O parvovírus B19 é o agente causador de eritemas infecciosos em crianças, hidropsia fetal em mulheres gestantes, esse vírus pode causar anemia crônica e crise aplástica transitória respectivamente. A levedura P. pastoris é um sistema de expressão usado na produção de várias proteínas heterólogas. O objetivo deste trabalho foi expressar as proteínas VP1 e VP2 do parvovírus humano B19 em levedura P. pastoris. As seqüências gênicas VP1 e VP2 foram amplificadas por PCR, usando DNA do vírus B19, os produtos obtidos foram inicialmente subclonados no vetor pGEM-TEasy. Os fragmentos de DNA foram digeridos com enzima de restrição EcoRI e NotI , purificados e inseridos no vetor de expressão e excreção pPIC9K de P. pastoris, entre os sítios EcoRI e NotI. Para expressão das proteínas recombinantes VP1 e VP2 de parvovírus humano B19, os transformantes foram crescidos em glicerol e induzidos pela adição de metanol. As expressões dos antígenos recombinantes foram analisadas por SDS-PAGE e atividade biológica foram confirmadas pelos ensaios imunológicos ELISA, Dot-Blot e Western Blot. / Human Parvovirus B19 is the causative agent of erythema infectiosum in children, hydrops fetalis in pregnant women, B19 may cause chronic anemia and aplastic crisis, respectively. The yeast P. pastoris expression system is being used for the production of various recombinant heterologous proteins. The objective of this work was to express the VP1 and VP2 proteins of the human parvovirus B19 in the yeast Pichia pastoris. The coding sequence of VP1 and VP2 were amplified by PCR, using DNA virus of B19. PCR-products were initially subcloned in the vector pGEM-TEasy. The DNA fragment EcoRI and NotI was excised, purified, and inserted between the sites EcoRI and NotI of P. pastoris expression-secretion vector pPIC9K.For heterologous expression of the proteins VP1 and VP2 Human parvovirus B19, the transformants were growth on glycerol and induced by the addition of methanol. The expressed recombinant antigens VP1 and VP2 were analyzed by SDS-PAGE and its biological activity were confirmed through Enzyme immunoassay EIA, Dot-Blot e Western Blot.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-28012019-162438 |
| Date | 10 December 2007 |
| Creators | Silva Filho, Claudionor Gomes da |
| Contributors | Vicente, Elisabete Jose |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | Tese de Doutorado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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