Em Leptospira interrogans algumas proteínas com capacidade de ligação aos componentes de matriz extracelular foram identificadas e, em sua maioria, são fatores de virulência. Phage display é considerada uma técnica poderosa na identificação de novos ligantes, inclusive de moléculas adesinas, importantes no primeiro estágio de infecção do hospedeiro. A técnica de shotgun phage display foi utilizada visando à obtenção de ligantes à células de mamíferos. Quatro bibliotecas, por inserção de fragmentos aleatórios obtidos por sonicação do DNA de L. interrogans nos fagomídeos pG8SAET (BBT1 e BBT2) e pG3DSS (BBT5 e BBT6), foram construídas. As bibliotecas BBT1 e BBT5 contém insertos maiores e as BBT2 e BBT6 contém insertos menores, com tamanhos médios de 1500 pb e 350 pb, respectivamente. Após ensaio de panning da BBT5 contra células de mamíferos e soro fetal bovino, as sequências de clones selecionados foram analisadas quanto a orientação correta e se a fusão estava em fase com a proteína pIII. As proteínas codificadas pelos genes LIC11719, LIC10769, LIC13143 e LIC12976 foram selecionadas com estas características. Os genes que codificam a LIC12976, LIC10768, LIC10769 e LIC13418, tiveram sua conservação avaliada em diferentes sorovares da espécie patogênica L. interrogans e no sorovar Patoc da espécie de vida livre L. biflexa. As proteínas LIC12976 (selecionada pela técnica de phage display) e LIC13418 (selecionada por ferramentas de bioinformática) tiveram suas sequências amplificadas por PCR, clonadas em pGEM T easy, subclonadas em vetor de expressão pAE e expressas na fração celular correspondente ao corpúsculo de inclusão em E. coli BL21 (DE3) Star pLysS e E. coli BL21 SI, respectivamente. Após renaturação e purificação destas proteínas por cromatografia de afinidade a metal bivalente, um grupo de cinco animais BALB/c fêmeas foi imunizado. Ambas as proteínas se mostraram imunogênicas com títulos dos soros policlonais 1:256000 e 1:512000, respectivamente. Em ensaio de Western Blot os soros foram específicos no reconhecimento das proteínas recombinantes e as proteínas nativas foram verificadas em extratos de sorovares patogênicos de L. interrogans. Em ensaios de adesão, as proteínas recombinantes aderiram às células A31, LLC-PK1 e Vero e especificamente à laminina. Em ensaios de interferência em células usando laminina houve um aumento da adesão das proteínas recombinantes, o que pode ser explicado pela ligação da laminina às células e uma maior ligação das LICs estudadas. Em ensaio de localização celular usando imunofluorescência e microscopia eletrônica, foi observado que ambas as proteínas se encontram na superfície da L. interrogans. No experimento de desafio animal, a LIC12976 e a LIC13418 não se mostraram protetoras. Este trabalho contribuiu para a identificação das novas adesinas LIC13418 e LIC12976 que podem participar da virulência de leptospiras patogênicas envolvendo a primeira etapa da infecção na interação patógeno-hospedeiro / In Leptospira interrogans, proteins capable to bind to extracellular matrix components have been identified and most of them are important virulence factors. Phage display is a powerful technique to identify new ligands, including adhesin molecules that are important in the first stage of host infection. A shotgun phage display technique was used in order to obtain cell ligands. Four libraries were constructed by inserting random fragments obtained by sonication of L. interrogans DNA into phagemids pG8SAET (BBT1 and BBT2) and pG3DSS (BBT5 and BBT6). The libraries BBT1 and BBT5 contain larger inserts and BBT2 and BBT6 contain smaller inserts, with 1500 bp and 350 bp average sizes, respectively. After panning of BBT5 against mammalian cells and bovine fetal serum, the sequences of selected clones were analyzed for correct orientation and fusion with pIII protein. The proteins encoded by genes LIC11719, LIC10769, LIC13143 and LIC12976 were selected. The genes LIC12976, LIC10768, LIC10769 and LIC13418 were evaluated for their conservation in different pathogenic serovars of L. interrogans and free-living L. biflexa serovar Patoc. Proteins LIC12976 (selected by phage display technique) and also LIC13418 that was selected by bioinformatic tools, were amplified by PCR, cloned into pGEM T easy, subcloned into expression vector pAE and expressed in cellular fraction corresponding to the inclusion body in E. coli BL21 (DE3) Star pLysS and E. coli BL21 SI, respectively. After protein renaturation protocol and purification by affinity chromatography, a group of five BALB/c mice was immunized with the purified proteins. Both proteins were shown to be immunogenic with 1:256000 and 1:512000 polyclonal sera titers, respectively. In Western blot the sera were specific to recognize recombinant proteins and native proteins were detected in pathogenic L. interrogans serovars extracts. In binding assays, recombinant proteins bind to A31, LLC-PK1 and Vero cells and specifically to laminin. In interference cell assay using laminin there was an increase of recombinant protein bindings, which can be explained by the laminin binding to cells and further binding of the recombinant LICs. In cellular localization assay using immunofluorescence and electron microscopy, it was observed that both are surface proteins of L. interrogans. In the animal challenge, the LIC12976 and LIC13418 were not protective. As a whole, this work contributed to the identification of LIC12976 and LIC13418 as new adhesins and they can participate in the virulence of pathogenic Leptospira in the first stage of host pathogen interaction.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-02052013-095417 |
| Date | 06 February 2013 |
| Creators | Lima, Swiany Silveira |
| Contributors | Ho, Paulo Lee |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | Tese de Doutorado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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