Devido à grande preocupação com a geração de novas tecnologias mais ágeis, eficientes e de baixo custo, as reações fotodinâmicas (RF) têm ganhado destaque. Estas envolvem a ativação de um fármaco fotossensível (fotossensibilizador (FS)), pela iluminação em uma faixa específica de comprimentos de onda, gerando assim espécies reativas altamente citotóxicas levando as células à morte. As RF são divididas em duas categorias: terapia fotodinâmica (TFD) e inativação fotodinâmica (IFD). A primeira é utilizada para tratamentos oncológicos, dermatológicos, entre outros. A segunda é utilizada para descontaminação de micro-organismos em infecções localizadas. Atualmente a IFD tem sido alvo de muitos estudos pois tem diversas vantagens quando comparadas com as técnicas de descontaminação atuais. Duas das mais importantes são: a seletividade e a não geração de micro-organismos resistentes aos FSs. Apesar desta técnica ser utilizada com sucesso em diversos campos, ela ainda apresenta baixa eficiência quando comparada às técnicas tradicionais. Neste contexto, o objetivo deste trabalho foi criar um novo protocolo de aplicação da IFD visando o aumento de eficiência, bem como um estudo profundo das interações dos FSs com as células, e o monitoramento da dinâmica do FS nestas. O presente estudo utiliza-se de células da levedura Candida albicans e demonstra a interação destas células com dois FSs: Photogem® e Curcumina. Foi proposto um novo protocolo que promove o aumento da internalização de FS pelas células baseado na pré-iluminação de baixa dose durante o tempo de incubação. Foi possível demonstrar através da medida dos espectros de absorção do sobrenadante de uma solução com células e Photogem®, que as amostras que tiveram pré-iluminação internalizaram mais FS do meio do que as células mantidas no escuro. Além disso, a partir de ensaios de viabilidade com a levedura e o Photogem® foi demonstrado que as amostras que tiveram pré-iluminação apresentaram diminuição de até seis ordens de grandeza nas unidades formadoras de colônia quando comparadas com as amostras tratadas pelo protocolo tradicional de IFD. Através das técnicas de microscopia confocal de fluorescência e de imagem de tempo de vida de fluorescência foi possível compreender a interação entre os FSs e as células, bem como estudar a ligação deste FS em diferentes regiões da célula. Além disso, foi estudada ainda a mobilidade destas moléculas dentro das células sob condições com e sem iluminação de baixa dose. Através deste estudo pôde-se inferir que as moléculas de curcumina tem tempos característicos de entrada nas células mais lentos que os tempos característicos do Photogem®. Ainda foi possível tomar vantagem da fluorescência do Photogem® para monitorar a entrada deste nas células de levedura, bem como monitorar a formação do seu fotoproduto, determinando assim que 7,5 minutos é o tempo médio de iluminação durante a incubação com FS necessário para que pelo menos 80% das células tivessem o FS internalizado, sem significante formação de fotoprodutos. Conclui-se ainda que este novo protocolo de incubação com iluminação leva a maior eficiência e seletividade da IFD, abrindo caminho para uma nova linha de pesquisa nas RF em geral, possivelmente podendo este protocolo ser aplicado em diversos tipos de células. / In the last years, due to the increasing need of generation of novel faster and cheaper technologies, the photodynamic reactions (PR) have been highlighted. These reactions involves the activation of a photosensitive drug, named photosensitizer (PS), by light in proper spectral window and generation of highly cytotoxic reactive species, leading cells to death. The photodynamic reactions may be divided in two categories: photodynamic therapy (PDT) and photodynamic inactivation (PDI). The first one is performed in order to treat oncologic, dermatologic and other diseases, whereas the second one is employed in the decontamination of microorganisms in localized infections. When compared with existing decontamination techniques, PDI has several advantages, among which two of the most important are its selectivity of the PS that acts only at the delivered site, as well as not inducing antibiotic resistance, for such reasons are subjected of many current studies. Althought this technique has been performed with great success in many fields, it still has a lack of efficiency. In this context, the purpose of this study was create a new application protocol of this technique in order to increase the efficiency, as well as understand the interactions of the PS with the cells and monitoring the drug dynamic in cells. In this study, Candida albicans cells were utilized and the interaction of two PSs (Photogem® and Curcumin) were demonstrated. A new protocol which promotes an increase of the PS cells uptake was proposed, this protocol is based on the low dose illumination during the incubation time. By measuring absorption spectra of the supernatant of two solutions with cells and Photogem®, in which in one of them were applied a low dose light, was demonstrated that the illuminated cells had an uptake increased when compared with the sample kept in the dark. Moreover, viability assays with the Photogem® and the cells proved that the cells that receive low dose light in the incubation stage had more damage in the PDI, showing a decrease of six orders of magnitude when compared with the traditional PDI. Through confocal and lifetime fluorescence microscopy techniques it was possible not only to comprehend the interaction between the PS and cells, as well as to study the binding of this molecules in different regions of the cells. Furthermore, the mobility of the PS molecules inside the cells was studied in conditions of illumination and dark, it could be inferred that the curcumin molecules has higher characteristic time than Photogem® molecules. Monitoring the cell Photogem® uptake, and the photoproduct formation was possible by take advantage of the PS fluorescence. Thus it was possible to determine the average illumination time (7.5 minutes) during the incubation time so at least 80% of the cells had the PS internalized, without much generation of photoproducts. It follows also that this new incubation protocol with low dose illumination leads to greater efficiency of PDI, so this study leads a new field of research in overall photodynamic reaction.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-21102016-103320 |
| Date | 28 July 2016 |
| Creators | Romano, Renan Arnon |
| Contributors | Guimarães, Francisco Eduardo Gontijo |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | Dissertação de Mestrado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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