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Previous issue date: 2010-12-20 / Leptospirosis is a serious infectious disease caused by pathogenic spirochetes of the
genus Leptospira, it is classified as a zoonosis of worldwide distribution. This disease
results morbidity and mortality in humans and animals, justifying the application of
prophylactic strategies. Current vaccines against leptospirosis are composed of
inactivated bacteria and do not stimulate cross-protection. Thus, there is need to
develop a safe and effective vaccine. In this study, we used the outer membrane
proteins LigANI e LipL32, because they have been identified as vaccinogens. These,
in their recombinant form, are usually expressed in Escherichia coli and as subunit
vaccines have shown variable efficacy. We describe in this work the use of Pichia
pastoris as an alternative expression system. The genes ligANI and lipL32 were
cloned into vector pPICZαB, which allowed the secretory expression of proteins in P.
pastoris. The protein yield in this system was 276 mg/L for LigANI and 285 mg/L for
LipL32. The recombinant proteins were glycosylated and remained antigenic. The
immunoprotective potential was evaluated in the hamster model, challenged with
virulent L. interrogans serovar Copenhageni. Both proteins induced high levels of
antibodies (P < 0.001). The animals immunized with LigANI and LipL32 using
aluminium hydroxide as adjuvant, showed no protection against challenge, but
showed a significant increase in survival (P < 0.001). In conclusion, the yeast
P. pastoris has proved an efficient heterologous expression system of LigANI and
LipL32 L. interrogans proteins. The secreted and glycosylated LigANI protein may be
used in the control of leptospirosis, although additional studies are needed. / Leptospirose é uma doença infecciosa grave causada por espiroquetas patogênicas
do gênero Leptospira, sendo classificada como uma zoonose de ampla distribuição
mundial. Esta doença resulta morbidade e mortalidade em humanos e animais,
justificando a aplicação de estratégias profiláticas. As vacinas atuais contra a
leptospirose são compostas por bactérias inativadas e não estimulam proteção
cruzada. Assim, existe a necessidade de desenvolver uma vacina efetiva. No
presente estudo, as proteínas de membrana externa LigANI e LipL32 foram
utilizadas, pois são apontadas como potenciais vacinógenos. Estas, em sua forma
recombinante, costumam ser expressas em Escherichia coli e, como vacina de
subunidade tem apresentado eficiência variável. Nós descrevemos neste trabalho a
utilização da levedura Pichia pastoris como sistema de expressão alternativo. Os
genes ligANI e lipL32 foram clonados no vetor pPICZαB, que permitiu a expressão
secretória das proteínas em P. pastoris. O rendimento das proteínas neste sistema
foi de 276 mg/L para LigANI e 285 mg/L para LipL32. As proteínas recombinantes
foram glicosiladas e mantiveram-se antigênicas. O potencial imunoprotetor das
proteínas foi avaliado em modelo hamster desafiado com cepa virulenta de L.
interrogans sorovar Copenhageni. Ambas as proteínas induziram altas taxas de
anticorpos (P < 0,001). Os animais imunizados com LigANI e LipL32, utilizando
hidróxido de alumínio como adjuvante, não apresentaram proteção contra o desafio,
mas demonstraram um aumento significativo na sobrevida (P < 0,001). Em
conclusão, a levedura P. pastoris demonstrou ser um eficiente sistema de expressão
heterólogo das proteínas LigANI e LipL32 de L. interrogans. A proteína LigANI
secretada e glicosilada pode ser utilizada no controle da leptospirose, embora
estudos adicionais sejam necessários.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:repositorio.ufpel.edu.br:123456789/1278 |
| Date | 20 December 2010 |
| Creators | Hartwig, Daiane Drawanz |
| Contributors | CPF:42251850015, http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4723107D9, Conceição, Fabrício Rochedo, CPF:91985757087, http://lattes.cnpq.br/9342312279387017, Dellagostin, Odir Antônio |
| Publisher | Universidade Federal de Pelotas, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia, UFPel, BR, Biotecnologia |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Format | application/pdf |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UFPEL, instname:Universidade Federal de Pelotas, instacron:UFPEL |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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