Conselho Nacional do Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Os terpenos constituem a classe de produtos naturais com maior diversidade química e estrutural, estando associados ao metabolismo das plantas e às interações destas com outros organismos. Estes compostos, as enzimas que os sintetizam e as plantas que os produzem são amplamente estudados em diferentes aspectos. Para melhor compreensão da expressão de terpenos em plantas sob estresse biótico, as espécies Varronia curassavica e Pistacia palaestina foram estudadas neste trabalho. Folhas de V. curassavica contém óleo essencial rico em sesquiterpenos com propriedades anti-inflamatórias, especialmente α-humuleno and β-cariofileno. O objetivo deste estudo foi avaliar as respostas do seu metabolismo em função da aplicação de dois eliciadores naturais no conteúdo de sesquiterpenos de V. curassavica. Para isso, as plantas receberam a aplicação de acibenzolar-S-metil (500 mg L-1), 1,6 β-D-glucano obtido a partir de Lasiodiplodia theobromae (50 mg L-1) e água destilada como controle, sendo realizada as avaliações de trocas gasosas, atividade das enzimas fenilalanina amônia-liase, superóxido dismutase, peroxidase e catalase, bem como a análise química do óleo essencial. Acibenzolar-S-metílico reduziu significativamente a taxa líquida de assimilação de carbono e a concentração intercelular de CO2, enquanto que 1,6 β-D-glucano reduziu significativamente apenas a concentração intercelular de CO2. O maior rendimento de óleo essencial (0.819%) foi obtido em plantas eliciadas por 1,6 β-D-glucano. As proporções relativas e a quantidade de α-humuleno e β-cariofileno não diferiram entre os tratamentos, porém os eliciadores aumentaram significativamente a atividade da enzima guaiacol peroxidase. Os terpenos estão presentes nas folhas e galhas de Pistacia palaestina. Apesar do mecanismo de desenvolvimento das galhas ainda não ter sido completamente elucidado, sabe-se que espécies de afídeos como Baizongia pistaciae L. manipulam anatomicamente, fisiologicamente e quimicamente as plantas hospedeiras em seu benefício. Por este motivo, o isolamento e a caracterização funcional dos genes que codificam terpeno sintases em galhas induzidas por B. pistaciae, bem como sua expressão relativa por RT-qPCR em folhas e galhas de P. palaestina foram os objetivos deste trabalho. A expressão heteróloga foi realizada em E. coli pLYS-BL21, sendo as reações enzimáticas feitas com proteínas purificadas e usando geranil difosfato (GPP) ou farnesil difosfato (FPP) para testar a atividade das enzimas como mono- e sesquiterpeno sintases, respectivamente. Para o experimento de RT-qPCR, foi selecionado um gene referência entre actina, ciclofilina, fosfoglicerato quinase, RNA polimerase II, α-tubulina e ubiquitina. Em seguida, realizaram-se reações com as terpeno sintases para avaliar as diferenças nos níveis de expressão em folhas não colonizadas e galhas. Foram isoladas e caracterizadas duas monoterpeno sintases (PpTPS281 e PpTPS809) e uma sesquiterpeno sintase (PpTPS232) em P. palaestina. PpTPS281 produziu exclusivamente D-limoneno a partir de GPP, enquanto PpTPS809 produziu vários monoterpenos a partir de GPP e PpTPS232 catalisou a formação de diferentes sesquiterpenos a partir de FPP. Os resultados da RT-qPCR mostraram que o gene actina é o mais apropriado para ser usado na comparação de expressão de genes de folhas não colonizadas e galhas induzidas por B. pistaciae. Os níveis de expressão dos três genes foram significativamente aumentados em galhas (de 2,21- a 96.5-vezes), quando comparados com folhas. / Terpenes are a large and diverse class of natural products, being associated with plant metabolism and interactions with other organisms. Nowadays compounds and enzymes of the terpenes pathway in plants are widely studied in different aspects. Varronia curassavica and Pistacia palaestina were the selected species to study the biotic stress effects on terpenoids expressions. Leaves of V. curassavica are the commercial source α-humulene and β-caryophyllene, sesquiterpenes with anti-inflammatory properties. The objective of this study was to evaluate the effect of two natural elicitors on the sesquiterpene content of V. curassavica. Thus, field grown plants received the application of acibenzolar-S-methyl (500 mg L-1), 1,6 -D-glucan obtained from Lasiodiplodia theobromae (50 mg L-1) and distilled water as a control. Gas exchange rate, terpene enzymes such as phenylalanine ammonia-lyase, superoxide dismutase, guaiacol peroxidase and catalase activity and essential oil content in leaves were measured. Acibenzolar-S-methyl reduced significantly the net carbon assimilation rate and the intercellular CO2 concentration, while1,6 -D-glucan reduced significantly only the intercellular CO2 concentration. The highest essential oil yield (0.819%) was obtained in plants elicited with 1,6 -D-glucan. The content of α-humulene and β-caryophyllene did not differ among treatments however the elicitors provided a significant increase in guaiacol peroxidase activity. Terpenes are present in Pistacia palaestina in leaves and in horn-shaped galls. The mechanism of gall development remains unknown, however it is clear Baizongia pistaciae L., an aphid species, manipulates their hosts anatomy, physiology, and chemistry for their own benefit. To isolate and functional characterize terpene synthase genes from galls induced by B. pistaciae as well as their gene relative expression by RT-qPCR in leaves and galls of P. palestina were the aims of this study. The heterologous expression was performed in E. coli pLYS-BL21 cells, being enzymatic assay reactions made with the purified proteins using geranyl diphosphate (GPP) or farnesyl diphosphate (FPP) to test for possible mono- and sesquiterpene synthase activity, respectively. For relative real-time PCR, it was selected an appropriate reference gene between actin, cyclophilin, phosphoglycerate kinase, RNA polymerase II, α-tubulin and ubiquitin. After selection, it was performed reactions with terpene synthases genes to evaluate differences in expression levels in P. palaestina non-colonized leaves and galls. Two monoterpene synthases (PpTPS281 and PpTPS809) and one sesquiterpene synthase (PpTPS232) were isolated and characterized in P. palaestina. PpTPS281 produced exclusively D-limonene from GPP, while PpTPS809 produced several monoterpenes from GPP and PpTPS232 catalyzed the formation of different sesquiterpenes from FPP. Real-time PCR results showed that actin is the most proper gene to be used for genes expression studies between non-colonized P. palaestina leaves and galls induced by B. pistaciae. The levels of expression of the genes were significantly upregulated in galls (from 2,21- to 96.5-fold) when compared to leaves.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:repositorio.utfpr.edu.br:1/3260 |
| Date | 15 March 2018 |
| Creators | Hoppen, Carolina |
| Contributors | Marchese, José Abramo, Marques, Marcia Ortiz Mayo, Finatto, Taciane, Marchese, José Abramo, Waclawovsky , Alessandro Jaquiel, Moraes, Rita Maria de, Lewinsohn, Efraim, Behrens, Maria das Dores Dutra |
| Publisher | Universidade Tecnológica Federal do Paraná, Pato Branco, Programa de Pós-Graduação em Agronomia, UTFPR, Brasil |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | English |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UTFPR, instname:Universidade Tecnológica Federal do Paraná, instacron:UTFPR |
| Rights | info:eu-repo/semantics/embargoedAccess |
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