EINLEITUNG:
In der Diagnostik mittels Positronen-Emissions-Tomographie (PET) liegt ein großes Potential hinsichtlich Diagnostik und Therapie einer Vielzahl von Erkrankungen. Gerade das radioaktive Isotop 18F eignet sich aufgrund hervorragender Zerfallseigenschaften besonders gut für die Entwicklung neuer Radiotracer für den klinischen Einsatz. Dabei haben sich Aminosäure (AS)-Tracer besonders bei der Darstellung von zerebralen Tumoren bewährt. Dies ist insbesondere auf eine erhöhte AS- Transportrate sowie eine erhöhte Proteinbiosyntheserate im Tumorgewebe zurückzuführen.
ZIELE DER UNTERSUCHUNGEN:
Eine große Hürde in der PET-Diagnostik besteht in der Entwicklung neuer Tracer, welche sich für den klinischen Einsatz eignen. Denn auch die Qualität von PET-Untersuchungen hängt stark von der Entwicklung selektiver PET-Tracer ab. Ziel dieser Studie war es daher, die neu entwickelten Phenylalanin (Phe)-Tracer zunächst in vitro zu evaluieren, bevor die Tracer bei erfolgsversprechenden Ergebnissen in verschiedenen subkutanen sowie orthotopen Tumormodellen in vivo eingesetzt wurden. Ein besonderes Augenmerk wurde auf die Entwicklung neuer Tracer für die Darstellung zerebraler Glioblastome gelegt, da diese nach wie vor meist zu einem späten Erkrankungszeitpunkt diagnostiziert werden und mit einer hohen Mortalität einhergehen.
TIERE, MATERIAL UND METHODEN:
Insgesamt 5 Tracer – 3-L-[18F]FPhe, 3-D-[18F]FPhe sowie α-Methyl-2-,3- und 4-[18F]FPhe – wurden hinsichtlich ihrer Bildeigenschaften im PET evaluiert. Als Referenztracer wurde jeweils der bereits etablierte Tracer [18F]Fluoroethyltyrosin ([18F]FET) eingesetzt. Zunächst wurde die prinzipielle Eignung der Tracer anhand von in vitro Zellaufnahmeversuchen an verschiedenen humanen Tumorzelllinien (MCF-7, PC-3 und U87 MG) evaluiert. Erste in vivo Versuche zur Biodistribution wurden an gesunden weiblichen und männlichen Ratten (Long Evans, je n=6) durchgeführt. Im Anschluss erfolgten Untersuchungen an einem subkutanen Tumormausmodell (männliche SCID-Mäuse, n=18) sowie einem orthotopen Gehirntumormodell an der Ratte (männliche RNU-Ratten, n=24).
ERGEBNISSE:
Die in vitro Traceraufnahme der evaluierten Phe-Tracer war höher oder ähnlich im Vergleich zu [18F]FET. Vor allem das AS-Transportsystem L sowie ASC waren am Transport der AS-Tracer beteiligt. Eine Proteininkorporation konnte für den Tracer 3-L-[18F]FPhe nachgewiesen werden. Insgesamt zeigten alle Tracer eine hohe metabolische Stabilität in gesunden Tieren in vivo. Die höchste Gehirnaufnahme wurde für die Tracer 3-L-[18F]FPhe, 3-D-[18F]FPhe sowie αM-3-[18F]FPhe beobachtet. Im subkutanen Tumormodell wiesen alle Tracer ähnliche Tumorbildgebungseigenschaften auf. Lediglich αM-2-[18F]FPhe zeigte in den MCF-7 Tumoren signifikant niedrigere Tumorwerte im Vergleich zu [18F]FET. Auch im orthotopen Modell war zu beobachten, dass sich die neuen Phe-Tracer nur geringgradig von [18F]FET unterschieden. Hier zeigten sich in den ersten Minuten post injectionem (p.i.) signifikant höhere Traceraufnahmen für 3-L-[18F]FPhe sowie αM-3-[18F]FPhe im orthotopen Glioblastom. Das Tumor/Gehirn-Verhältnis zeigte jedoch keine signifikanten Unterschiede hinsichtlich der untersuchten Tracer.
SCHLUSSFOLGERUNGEN:
Insgesamt wiesen alle fünf evaluierten Tracer gute Tumorbildgebungseigenschaften auf. Die Enantiomere 3-L-[18F]FPhe und 3-D-[18F]FPhe unterschieden sich erstaunlicherweise kaum in ihrem biologischen Verhalten. Insbesondere für die Tracer 3-L-[18F]FPhe sowie αM-3-[18F]FPhe war eine hohe Tumortraceraufnahme zu beobachten. Alle Tracer ermöglichten eine sensitive Detektion orthotoper Glioblastome in der Ratte. Die signifikant höhere Tumoraufnahme von 3-L-[18F]FPhe sowie αM-3-[18F]FPhe in den ersten Minuten p.i. könnte die Scanzeiten von Gehirntumorpatienten verkürzen. Eine erhöhte Proteininkorporation zeigte keinen signifikanten Vorteil für 3-L-[18F]FPhe gegenüber [18F]FET. Insgesamt war kein klarer Vorteil gegenüber dem etablierten AS-Tracer [18F]FET zu sehen.:1. EINLEITUNG
2. LITERATURÜBERSICHT
2.1 Prinzip der Positronen-Emissions-Tomographie
2.2 Klinische Bedeutung von Phenylalanin.
2.3 Vor- und Nachteile Aminosäure-basierter PET-Tracer
2.4 Wichtige eingesetzte PET-Tracer in der zerebralen Tumorbildgebung
2.4.1 L-[methyl-11C]methionin ([11C]MET)
2.4.2 [11C]-α-Methyl-L-Tryptophan ([11C]AMT)
2.4.3 6-[18F]Fluor-L-3,4-dihydroxyphenylalanin ([18F]FDOPA)
2.4.4 [18F]Fluorethyltyrosin ([18F]FET)
2.5 Blut-Hirn-Schranke: Aufbau und tierartliche Unterschiede
2.5.1 Aufbau der Blut-Hirn-Schranke
2.5.2 Transport über die Blut-Hirn-Schranke
2.5.3 Tierartliche Unterschiede
2.5.4 Einfluss von Krankheiten auf die Blut-Hirn-Schranke
2.6 Aminosäurentransporter: Charakterisierung und Vorkommen in verschiedenen Tumorarten
2.6.1 Aminosäurentransportsystem L
2.6.1.1 LAT1/SLC7A5-Transporter
2.6.2 Aminosäurentransportsystem ASC
2.6.2.1 ASCT2/SLC1A5-Transporter
2.6.3 Aminosäurentransportsystem A
3. TIERE, MATERIAL UND METHODEN
3.1 Haltung der Versuchstiere
3.1.1 Haltung der Versuchsratten
3.1.2 Haltung der Versuchsmäuse
3.2 Anästhesie der Versuchstiere
3.3 Verwendete Materialien und Geräte
3.4 Verwendete Agenzien
3.5 Herstellung der 18F-markierten Tracer
3.5.1 Physikalische Grundlagen
3.5.2 Herstellung des radioaktiven Isotops 18F
3.5.3 Aminosäuren-Tracer auf Phenylalanin-Basis
3.6 Verwendete Zelllinien
3.6.1 U87 MG Zelllinie (humanes Glioblastom)
3.6.2 MCF-7 Zelllinie (humanes Brustadenokarzinom)
3.6.3 PC-3 Zelllinie (humanes Prostataadenokarzinom)
3.7 Zellaufnahmeversuche in vitro
3.7.1 Zellkultivierung
3.7.2 Versuchsdurchführung der zellulären Tracer-Aufnahme
3.7.3 Versuchsdurchführung der kompetitiven Inhibitionsstudien
3.7.4 Versuchsdurchführung der Proteininkorporation
3.7.5 Messung der zellulären Tracer-Aufnahme
3.8 Biodistributionsstudien in der gesunden Ratte
3.8.1 Versuchstiere
3.8.2 Versuchsaufbau
3.9 Subkutanes Tumor-Xenograft-Modell der Maus
3.9.1 Versuchstiere
3.9.2 Verwendete Zelllinien
3.9.3 Versuchsaufbau
3.9.4 Diagnostische Verfahren
3.10 Orthotopes Tumor-Xenograft-Modell der Ratte
3.10.1 Versuchstiere
3.10.2 Verwendete Zelllinie
3.10.3 Versuchsaufbau
3.10.4 Diagnostische Verfahren
3.10.5 Transkardiale Perfusion und Gehirnentnahme nach Versuchsende
3.11 PET-Messungen
3.11.1 Rekonstruktion der PET-Bilder
3.11.2 Auswertung der PET-Bilder mit der Software VINCI
3.11.3 Biodistributionsstudien in der gesunden Ratte
3.11.4 Subkutanes Tumor-Xenograft-Modell der Maus
3.11.5 Orthotopes Tumor-Xenograft-Modell der Ratte
3.12 Statistische Auswertung
4. ERGEBNISSE
4.1 Zellaufnahmeversuche in vitro
4.1.1 Zelluläre Tracer-Aufnahme
4.1.2 Kompetitive Inhibitionsstudien
4.1.3 Proteininkorporation
4.2 Biodistributionsstudien in der gesunden Ratte
4.2.1 3-L-[18F]Fluorphenylalanin
4.2.2 3-D-[18F]Fluorphenylalanin
4.2.3 α-Methyl-2-[18F]Fluorphenylalanin
4.2.4 α-Methyl-3-[18F]Fluorphenylalanin
4.2.5 α-Methyl-4-[18F]Fluorphenylalanin
4.2.6 Vergleichende Auswertung
4.3 Subkutanes Tumor-Xenograft-Modell der Maus
4.3.1 Versuchsablauf und Gewichtsentwicklung
4.3.2 PET-Messungen MCF-7 Zelllinie
4.3.3 PET-Messungen PC-3 Zelllinie
4.3.4 Vergleichende Auswertung
4.3.5 Histologische Verfahren
4.4.1 Versuchsablauf und Gewichtsentwicklung
4.4.2 MRT- und PET-Messungen
4.4.3 Vergleichende Auswertung
4.4.4 Immunhistochemie
5. DISKUSSION
5.1 Zellaufnahmeversuche in vitro
5.2 Biodistributionsstudien in der gesunden Ratte
5.3 Subkutanes Tumor-Xenograft-Modell der Maus
5.4 Orthotopes Tumor-Xenograft-Modell der Ratte
5.5 Synopsis: Gegenüberstellung der untersuchten Tracer
5.6 Ausblick
6. ZUSAMMENFASSUNG
7. SUMMARY
8. REFERENZEN
8.1 Abbildungsverzeichnis
8.2 Tabellenverzeichnis
8.3 Formelverzeichnis
8.4 Literaturverzeichnis
9. ANHANG
9.1 Subkutanes Tumor-Xenograft-Modell der Maus
9.1.1 PET-Bilder und TACs 3-L-[18F]Fluorphenylalanin
9.1.2 PET-Bilder und TACs 3-D-[18F]Fluorphenylalanin
9.1.3 PET-Bilder und TACs α-Methyl-2-[18F]Fluorphenylalanin
9.1.4 PET-Bilder und TACs α-Methyl-3-[18F]Fluorphenylalanin
9.1.5 PET-Bilder und TACs α-Methyl-4-[18F]Fluorphenylalanin
9.1.6 PET-Bilder und TACs [18F]Fluorethyltyrosin
9.2 Orthotopes Tumor-Xenograft-Modell der Ratte
9.2.1 MRT-und PET-Bilder 3-L-[18F]Fluorphenylalanin
9.2.2 MRT-und PET-Bilder 3-D-[18F]Fluorphenylalanin
9.2.3 MRT-und PET-Bilder α-Methyl-3-[18F]Fluorphenylalanin
9.2.4 MRT-und PET-Bilder [18F]Fluorethyltyrosin
9.3 Durchführung der histologischen Verfahren
9.3.1 Hämatoxylin-Eosin-Färbung
9.3.2 Anti-LAT1(SLC7A5)-Färbung
9.3.3 Anti-ASCT2(SLC1A5)-Färbung
9.4 Statistische Auswertung
9.4.1 Zellaufnahmeversuche in vitro
9.4.2 Biodistributionsstudien in der gesunden Ratte
9.4.3 Subkutanes Tumor-Xenograft-Modell der Maus
9.4.4 Orthotopes Tumor-Xenograft-Modell der Ratte
10. DANKSAGUNG / INTRODUCTION:
Positron emission tomography (PET) has gained great potential for the diagnosis and treatment of a wide range of diseases. The radioactive isotope 18F is particularly well suited for the development of new radiotracers for clinical use due to its excellent decay properties. Amino acids (AA) have proven particularly useful in the imaging of cerebral tumors due to an increased protein synthesis rate and AA transport rates in tumor tissue.
AIMS OF THE STUDIES:
A major difficulty in PET diagnostics is the development of new tracers which are suitable for clinical use. This is because the quality of PET imaging depends heavily on the development of selective PET tracers. The aim of the study was therefore to preclinically evaluate the newly developed phenylalanine (Phe) tracers. After principle suitability was seen in in vitro cellular experiments, further experiments were performed in subcutaneous as well as orthotopic tumor models in vivo. Particular attention has been paid to the development of new tracers imaging cerebral glioblastomas, as they are mostly still diagnosed late and are associated with high mortality.
ANIMALS, MATERIAL AND METHODS:
A total of 5 Phe-based tracers – 3-L-[18F]FPhe, 3-D-[18F]FPhe as well as α-Methyl-2-,3- and 4-[18F]FPhe – were evaluated with regard to their imaging properties in PET. The already established tracer [18F]fluoroethyltyrosine ([18F]FET) was used as reference tracer in each case. First, the principle suitability of the tracers was evaluated by in vitro cell uptake experiments on various human tumor cell lines (MCF-7, PC-3 and U87 MG). Next, in vivo biodistribution studies were carried out on healthy female and male rats (Long Evans, n=6). Subsequently, experiments with subcutaneous tumor bearing mice (male SCID mice, n=18) and an orthotopic brain tumor model in the rat (male RNU rats, n=24) were performed.
RESULTS:
The in vitro cellular uptake of the evaluated Phe-tracers was higher or similar compared to [18F]FET. Significant inhibition of cellular uptake was seen in blocking the AA transport systems L and ASC. Protein incorporation could be demonstrated for 3-L-[18F]FPhe. Overall, all tracers showed high in vivo metabolic stability in healthy animals. The highest brain uptake was observed for the tracers 3-L- [18F]FPhe, 3-D-[18F]FPhe and αM-3-[18F]FPhe. In the subcutaneous tumor model, all tracers showed similar tumor imaging properties. Only αM-2-[18F]FPhe showed significantly lower tumor levels in the MCF-7 tumors compared to [18F]FET. It was also observed in the orthotopic model that the new Phe- based tracers differed only slightly from [18F]FET. Significantly higher tracer uptakes for 3-L-[18F]FPhe as well as αM-3-[18F]FPhe were seen in the first minutes post injection (p.i.) in the orthotopic tumor. However, the tumor-to-brain-ratio showed no significant differences.
CONCLUSION:
All five tracers evaluated showed good tumor imaging properties. Surprisingly, the enantiomers 3-L- [18F]FPhe and 3-D-[18F]FPhe hardly differed in their biological behaviour. In particular, a high tumour tracer uptake was observed for the tracers 3-L-[18F]FPhe as well as αM-3-[18F]FPhe. All tracers enabled sensitive detection of orthotopic glioblastomas in the rat. The significantly higher tumor uptake of 3-L-[18F]FPhe and αM-3-[18F]FPhe in the first minutes p.i. could shorten the scan times of brain tumour patients. Increased protein incorporation showed no significant advantage for 3-L- [18F]FPhe over [18F]FET. In summary, no clear advantage was seen over the established AA tracer [18F]FET.:1. EINLEITUNG
2. LITERATURÜBERSICHT
2.1 Prinzip der Positronen-Emissions-Tomographie
2.2 Klinische Bedeutung von Phenylalanin.
2.3 Vor- und Nachteile Aminosäure-basierter PET-Tracer
2.4 Wichtige eingesetzte PET-Tracer in der zerebralen Tumorbildgebung
2.4.1 L-[methyl-11C]methionin ([11C]MET)
2.4.2 [11C]-α-Methyl-L-Tryptophan ([11C]AMT)
2.4.3 6-[18F]Fluor-L-3,4-dihydroxyphenylalanin ([18F]FDOPA)
2.4.4 [18F]Fluorethyltyrosin ([18F]FET)
2.5 Blut-Hirn-Schranke: Aufbau und tierartliche Unterschiede
2.5.1 Aufbau der Blut-Hirn-Schranke
2.5.2 Transport über die Blut-Hirn-Schranke
2.5.3 Tierartliche Unterschiede
2.5.4 Einfluss von Krankheiten auf die Blut-Hirn-Schranke
2.6 Aminosäurentransporter: Charakterisierung und Vorkommen in verschiedenen Tumorarten
2.6.1 Aminosäurentransportsystem L
2.6.1.1 LAT1/SLC7A5-Transporter
2.6.2 Aminosäurentransportsystem ASC
2.6.2.1 ASCT2/SLC1A5-Transporter
2.6.3 Aminosäurentransportsystem A
3. TIERE, MATERIAL UND METHODEN
3.1 Haltung der Versuchstiere
3.1.1 Haltung der Versuchsratten
3.1.2 Haltung der Versuchsmäuse
3.2 Anästhesie der Versuchstiere
3.3 Verwendete Materialien und Geräte
3.4 Verwendete Agenzien
3.5 Herstellung der 18F-markierten Tracer
3.5.1 Physikalische Grundlagen
3.5.2 Herstellung des radioaktiven Isotops 18F
3.5.3 Aminosäuren-Tracer auf Phenylalanin-Basis
3.6 Verwendete Zelllinien
3.6.1 U87 MG Zelllinie (humanes Glioblastom)
3.6.2 MCF-7 Zelllinie (humanes Brustadenokarzinom)
3.6.3 PC-3 Zelllinie (humanes Prostataadenokarzinom)
3.7 Zellaufnahmeversuche in vitro
3.7.1 Zellkultivierung
3.7.2 Versuchsdurchführung der zellulären Tracer-Aufnahme
3.7.3 Versuchsdurchführung der kompetitiven Inhibitionsstudien
3.7.4 Versuchsdurchführung der Proteininkorporation
3.7.5 Messung der zellulären Tracer-Aufnahme
3.8 Biodistributionsstudien in der gesunden Ratte
3.8.1 Versuchstiere
3.8.2 Versuchsaufbau
3.9 Subkutanes Tumor-Xenograft-Modell der Maus
3.9.1 Versuchstiere
3.9.2 Verwendete Zelllinien
3.9.3 Versuchsaufbau
3.9.4 Diagnostische Verfahren
3.10 Orthotopes Tumor-Xenograft-Modell der Ratte
3.10.1 Versuchstiere
3.10.2 Verwendete Zelllinie
3.10.3 Versuchsaufbau
3.10.4 Diagnostische Verfahren
3.10.5 Transkardiale Perfusion und Gehirnentnahme nach Versuchsende
3.11 PET-Messungen
3.11.1 Rekonstruktion der PET-Bilder
3.11.2 Auswertung der PET-Bilder mit der Software VINCI
3.11.3 Biodistributionsstudien in der gesunden Ratte
3.11.4 Subkutanes Tumor-Xenograft-Modell der Maus
3.11.5 Orthotopes Tumor-Xenograft-Modell der Ratte
3.12 Statistische Auswertung
4. ERGEBNISSE
4.1 Zellaufnahmeversuche in vitro
4.1.1 Zelluläre Tracer-Aufnahme
4.1.2 Kompetitive Inhibitionsstudien
4.1.3 Proteininkorporation
4.2 Biodistributionsstudien in der gesunden Ratte
4.2.1 3-L-[18F]Fluorphenylalanin
4.2.2 3-D-[18F]Fluorphenylalanin
4.2.3 α-Methyl-2-[18F]Fluorphenylalanin
4.2.4 α-Methyl-3-[18F]Fluorphenylalanin
4.2.5 α-Methyl-4-[18F]Fluorphenylalanin
4.2.6 Vergleichende Auswertung
4.3 Subkutanes Tumor-Xenograft-Modell der Maus
4.3.1 Versuchsablauf und Gewichtsentwicklung
4.3.2 PET-Messungen MCF-7 Zelllinie
4.3.3 PET-Messungen PC-3 Zelllinie
4.3.4 Vergleichende Auswertung
4.3.5 Histologische Verfahren
4.4.1 Versuchsablauf und Gewichtsentwicklung
4.4.2 MRT- und PET-Messungen
4.4.3 Vergleichende Auswertung
4.4.4 Immunhistochemie
5. DISKUSSION
5.1 Zellaufnahmeversuche in vitro
5.2 Biodistributionsstudien in der gesunden Ratte
5.3 Subkutanes Tumor-Xenograft-Modell der Maus
5.4 Orthotopes Tumor-Xenograft-Modell der Ratte
5.5 Synopsis: Gegenüberstellung der untersuchten Tracer
5.6 Ausblick
6. ZUSAMMENFASSUNG
7. SUMMARY
8. REFERENZEN
8.1 Abbildungsverzeichnis
8.2 Tabellenverzeichnis
8.3 Formelverzeichnis
8.4 Literaturverzeichnis
9. ANHANG
9.1 Subkutanes Tumor-Xenograft-Modell der Maus
9.1.1 PET-Bilder und TACs 3-L-[18F]Fluorphenylalanin
9.1.2 PET-Bilder und TACs 3-D-[18F]Fluorphenylalanin
9.1.3 PET-Bilder und TACs α-Methyl-2-[18F]Fluorphenylalanin
9.1.4 PET-Bilder und TACs α-Methyl-3-[18F]Fluorphenylalanin
9.1.5 PET-Bilder und TACs α-Methyl-4-[18F]Fluorphenylalanin
9.1.6 PET-Bilder und TACs [18F]Fluorethyltyrosin
9.2 Orthotopes Tumor-Xenograft-Modell der Ratte
9.2.1 MRT-und PET-Bilder 3-L-[18F]Fluorphenylalanin
9.2.2 MRT-und PET-Bilder 3-D-[18F]Fluorphenylalanin
9.2.3 MRT-und PET-Bilder α-Methyl-3-[18F]Fluorphenylalanin
9.2.4 MRT-und PET-Bilder [18F]Fluorethyltyrosin
9.3 Durchführung der histologischen Verfahren
9.3.1 Hämatoxylin-Eosin-Färbung
9.3.2 Anti-LAT1(SLC7A5)-Färbung
9.3.3 Anti-ASCT2(SLC1A5)-Färbung
9.4 Statistische Auswertung
9.4.1 Zellaufnahmeversuche in vitro
9.4.2 Biodistributionsstudien in der gesunden Ratte
9.4.3 Subkutanes Tumor-Xenograft-Modell der Maus
9.4.4 Orthotopes Tumor-Xenograft-Modell der Ratte
10. DANKSAGUNG
| Identifer | oai:union.ndltd.org:DRESDEN/oai:qucosa:de:qucosa:76737 |
| Date | 25 November 2021 |
| Creators | Krämer, Maximiliane-Felicia |
| Contributors | Universität Leipzig, Universität zu Köln |
| Source Sets | Hochschulschriftenserver (HSSS) der SLUB Dresden |
| Language | German |
| Detected Language | German |
| Type | info:eu-repo/semantics/acceptedVersion, doc-type:doctoralThesis, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis, doc-type:Text |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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