As lipases (triacilglicerol éster hidrolases E.C. 3.1.1.3) são importantes biocatalisadores devido à sua afinidade por vários substratos e à sua quimio, régio e enantiosseletividade. Elas atuam na hidrólise de triacilgliceróis para produção de ácidos graxos livres e na reação inversa (esterificação) em meios não aquosos. Uma lipase produzida por Geotrichum candidum (G. candidum) possui seletividade para a hidrólise das ligações ésteres de ácidos graxos insaturados de cadeia longa, como os ácidos oleico e linoleico, presentes em diversos triacilgliceróis. Esse tipo de seletividade permite que essas ligações sejam rapidamente hidrolisadas aumentando a velocidade e consequentemente a eficiência do processo de hidrolise de óleos vegetais. Entretanto, o alto custo das enzimas ainda é um fator limitante para sua ampla utilização. A imobilização, em suportes sólidos, pode ser uma alternativa para viabilizar o emprego das enzimas em processos industriais, permitindo seu reuso e ainda melhorarando sua estabilidade e/ou seletividade. Nesse contexto, o presente trabalho avaliou diferentes estratégias de imobilização, bem como a caracterização das propriedades catalíticas e a determinação dos parâmetros termodinâmicos da lipase produzida por G. candidum (LGC) via fermentação submersa, para a produção de ácidos graxos concentrados pela hidrólise de diferentes óleos vegetais (oliva, algodão e palmiste). Ensaios preliminares de imobilização da LGC em suportes hidrofóbicos (octil-agarose e octil-sílica) mostraram que estes não foram capazes de realizar a purificação da enzima do caldo de fermentação tão eficientemente quanto polihidroxibutirato (PHB) via imobilização, devido às diversas impurezas presentes no caldo de fermentação. Assim, a LGC bruta foi purificada via precipitação por solvente orgânico para melhor analisar a imobilização em diferentes tipos de suporte e por distintos métodos de imobilização, como a adsorção física e a iônica e a ligação covalente multipontual. Dentre estes métodos, a máxima atividade hidrolítica (45,4 ± 0,2 U/ g de biocatalisador) e a maior porcentagem de atividade recuperada (22,8 %) foram observadas para a imobilização de LGC por adsorção iônica em MANAE-agarose. Foram avaliadas as propriedades catalíticas da LGC purificada e imobilizada em MANAE-agarose, observando uma maior estabilidade da lipase em uma ampla faixa de pH e maior estabilidade térmica quando comparado com a enzima livre. A imobilização da LGC em MANAE-agarose também reduziu em 50% a energia de ativação (Ea) e aumentou a quantidade de produto formado em reações de hidrólise, verificado através do cálculo dos parâmetros cinéticos como a velocidade de reação máxima (vmáx) e a constante de Michaelis-Menten (Km). A hidrólise do óleo de oliva pela LGC imobilizada em MANAE-agarose sem a adição de emulsificantes atingiu 100% de hidrólise em 120 minutos de reação, sendo superior a enzima livre (95,5% em 140 min). No entanto, na reutilização do biocatalisador observou-se uma redução de 50% na reação de hidrólise para o segundo ciclo e de 5,5% para o terceiro ciclo. Os resultados obtidos na hidrólise dos óleos de algodão e de palmiste mostraram que a LGC livre expressa sua máxima atividade hidrolítica em pH 8,0 e temperatura de 37 °C, para ambos os substratos empregados. Entretanto, uma maior atividade foi observada para o óleo de algodão, devido à quantidade de ácidos graxos insaturados presentes em sua composição (≈ 71%) comparando-se com o óleo de palmiste (≈ 19%). / Lipases (triacylglycerol hydrolases E.C. 3.1.1.3) are important biocatalysts, due to their catalytic activity towards several substrates and their chemical, regio as well as stereo selectivity. They acts in the hydrolysis of triacylglycerols in order to produce free fatty acids, and in the inverse reaction (esterification) in non-aqueous mediums. Some lipases produced by Geotrichum candidum (G. candidum) possess selectivity with the hydrolysis of the long-chain unsaturated fatty acid ester bonds, like oleic and linoleic acids that are present in several triacylglycerols. This type of selectivity allows these bonds to be rapidly hydrolyzed, increasing the speed and consequently the efficiency of the vegetable oils hydrolysis. However, the high cost of enzymes is still a limiting factor for their widespread use. Immobilization on solid supports can be a viable alternative to the use of enzymes in industrial processes, allowing its reuse and to improve their stability and/or selectivity. In this context, the present work allowed the evaluation of different immobilization strategies, as well as the characterization of catalytic properties and the determination of thermodynamic parameters of a produced lipase from G. candidum (GCL) via submerged fermentation, in order to produce concentrated fatty acids by the hydrolysis of different vegetable oils (olive, cottonseed and palm kernel). Preliminary assays of free GCL immobilization on hydrophobic supports (octyl-agarose and octyl-silica) showed that they were not able to carry out the enzyme purification from fermentation broth as efficiently as polyhydroxybutyrate (PHB) via immobilization, due to the impurities in the fermentation broth. GCL produced was purified by precipitation with organic solvent in order to better analyze the immobilization on different types of support and by different immobilization methods, as via physical and ionic adsorption and multipoint covalent attachment. Among these methods, the maximum hydrolytic (45.4 ± 0,2 U/ g of biocatalyst) and the highest percentage of activity recovered (22.8%) were observed for GCL immobilized by ionic adsorption in MANAE-agarose. The catalytic properties of GCL purified and immobilized on MANAE-agarose were evaluated, a greater lipase stability over a broad pH range, and high thermal stability were observed as compared to the free enzyme. Immobilization of GCL on MANAE-agarose decreased the activation energy (Ea) by 50% and increased the amount of product formed during hydrolysis reactions, it was verified by calculating kinetic parameters such as the maximum reaction rate (vmáx) and the Michaelis-Menten constant (Km). The hydrolysis of olive oil by GCL immobilized on MANAE agarose, without the addition of emulsifiers, reached 100% hydrolysis in 120 minutes of reaction, whereas free enzyme reached 95.5% in 140 min. However, reusability tests of the biocatalyst showed that it retained around 50% of its original activity after second cycle, and only 5.5% after third cycle. The obtained results in the hydrolysis of cottonseed and palm kernel oils showed that free GCL expressed a maximum hydrolytic activity at pH 8.0 and temperature of 37 °C, for both used substrates. However, a greater activity was observed for cottonseed than for palm kernel, due the percentage of unsaturated fatty acids in cottonseed oil composition (≈ 71%) compared to palm kernel oil composition (≈ 19%). / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:10.254.254.39:tede/1026 |
| Date | 09 June 2017 |
| Creators | FERREIRA, Matheus Moreira |
| Contributors | HIRATA, Daniela Battaglia, http://lattes.cnpq.br/5292381247624407, BASSO, Rodrigo Corrêa, http://lattes.cnpq.br/9747718970743175, MENDES, Adriano Aguiar, TARDIOLI, Paulo Waldir |
| Publisher | Universidade Federal de Alfenas, Instituto de Ciência e Tecnologia, Brasil, UNIFAL-MG, Programa de Pós-Graduação em Engenharia Química |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Format | application/pdf |
| Source | reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da UNIFAL, instname:Universidade Federal de Alfenas, instacron:UNIFAL |
| Rights | http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/, info:eu-repo/semantics/openAccess |
Page generated in 0.0031 seconds