La structure coiffe est une structure protectrice retrouvée à l'extrémité 5' des ARN messagers (ARNm). Elle est requise pour la stabilité, le transport, l'épissage et la traduction des ARNm.La coiffe est synthétisée par trois activités enzymatiques successives : les activités ARN 5'-triphosphatase, ARN guanylyltransférase et ARN (guanine-7) méthyltransférase. Cette structure doit de plus être dégradée par des enzymes spécifiques pour permettre le recyclage des ARNm. Plusieurs protéines virales ont été découvertes possédant l'une ou l'autre de ces diverses activités de synthèse et de dégradation de la structure coiffe. Ces enzymes viraux représentent donc des modèles très intéressants pour étudier ces activités catalytiques, permettant soit de mieux comprendre les mécanismes similaires chez les métazoaires, ou de cibler ces activités chez les virus à l'aide de molécules inhibitrices. Cette thèse présente l'étude des plus petites ARN 5'-triphosphatases et ARN guanylyltransférase connues à ce jour, les protéines A449R et A103R du virus Paramecium bursaria chlorella de type 1, ainsi que du premier enzyme viral de dégradation de la structure coiffe découvert : la protéine D10 du virus de la vaccine. L'étude de l'ARN 5'-triphosphatase A449R a permis de déterminer l'implication des acides aminés Glu24, Glu26 et Glu165 dans l'interaction avec des ions divalents au centre catalytique de l'enzyme, ainsi que leur nature essentielle pour l'activité ARN 5'-triphosphatase. De plus, les résultats obtenus démontrent que l'interaction de l'enzyme avec les ions ne stabilise pas l'interaction de l'enzyme avec son substrat d'ARN, tel que précédemment observé avec l'ARN triphosphatase de la levure Saccharomyces cerevisiae. Chez A449R, la liaison des ions semble plutôt positionner les acides aminés du centre catalytique pour la catalyse. Ces données démontrent que des enzymes reliés au niveau phylogénique possèdent des mécanismes distincts pour une même activité essentielle de synthèse de la structure coiffe. Ces particularités pourraient être ciblées pour le développement d'antiviraux ou d'antifongiques spécifiques. Parallèlement, une caractérisation cinétique complète de toutes les étapes du mécanisme d'ARN guanylyltransférase de la protéine A103R a été entreprise.La production d'un schéma de l'énergie libre impliquée dans le déroulement de la réaction a permis de préciser l'étape limitante du mécanisme, ainsi que la nature spontanée de la réaction in vitro . Les ARN guanylyltransférases étant très conservées entre les métazoaires, levures et virus, cette caractérisation a permis d'acquérir quantité d'information sur ce mécanisme catalytique peu connu. Cette étude nous mène au questionnement des implications pour la cellule de la synthèse exclusive d'une coiffe guanosine par les ARN guanylyltransférases. Finalement, la caractérisation du mécanisme d'action de la protéine D10 ainsi que la modélisation du site actif de l'enzyme ont permis de générer le premier modèle mécanistique pour un enzyme viral de dégradation de la structure coiffe. Ce mécanisme est régi par la présence de deux ions divalents et d'une molécule d'eau coordonnée par les acides aminés Glu141, Glu145 et Glu132 respectivement. Étant donné le peu de conservation de la séquence primaire entre cet enzyme viral et les enzymes de dégradation de la coiffe des métazoaires, il est possible que le mécanisme utilisé par ces enzymes diffère du mécanisme découvert pour la protéine D10. Cet enzyme deviendrait donc une cible virale potentielle supplémentaire.La caractérisation de ces trois protéines virales a permis d'accroître significativement notre connaissance mécanistique fondamentale des activités catalysées par ces enzymes retrouvés tant chez les virus que chez l'humain et les levures. L'étude de l'ARN 5'-triphosphatase A449R a démontré que des enzymes très proches au niveau phylogénique peuvent posséder des mécanismes divergents. De plus, des études futures pourront démontrer dans quelles mesures les mécanismes découverts pour l'ARN guanylyltransférase A103R et l'enzyme de dégradation de la coiffe D10 seront applicables à d'autres enzymes de même famille présents chez d'autres organismes. Il serait intéressant de poursuivre ces études en incorporant une utilisation accrue de la bioinformatique pour la modélisation des structures tertiaires des enzymes viraux, ainsi que l'utilisation de collections d'analogues de nucléotides pour caractériser les sites actifs des enzymes et ouvrir la voie au développement d'inhibiteurs.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usherbrooke.ca/oai:savoirs.usherbrooke.ca:11143/4307 |
| Date | January 2010 |
| Creators | Soulière, Marie |
| Contributors | Bisaillon, Martin, Perreault, Jean-Pierre |
| Publisher | Université de Sherbrooke |
| Source Sets | Université de Sherbrooke |
| Language | French |
| Detected Language | French |
| Type | Thèse |
| Rights | © Marie Soulière |
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