O gene SPARC (secreted protein, acidic, cysteine-rich; também denominado de Osteonectina; BM-40) codifica uma proteína de 42kDa, membro de uma família de proteínas matricelular, que interagem com receptores de superfície celular, fatores de crescimento e componentes da matriz extracelular (ECM). SPARC desempenha importante papel no remodelamento de tecidos, migração celular, angiogênese, desenvolvimento embrionário, tumorigênese e quimiosensibilidade. O Docetaxel é um agente anti-microtúbulo pertencente à classe do taxanos, sendo utilizado como uma droga quimioterápica eficaz para o tratamento do câncer da mama avançado. No entanto, é considerável o número de pacientes que não respondem ou adquirem resistência ao tratamento com os taxanos. Os mecanismos envolvidos na resistência ao docetaxel ainda não estão completamente estabelecidos. Em um estudo prévio de nosso grupo, identificamos os transcritos do gene SPARC como diferencialmente expressos em células epiteliais mamárias expressando diferentes níveis de HER-2. No presente estudo, nós avaliamos o efeito da expressão do SPARC na sensibilidade de células de câncer de mama ao Docetaxel. As células MCF-7 foram transfectadas com o vetor de expressão pCMV6-SPARC ou pCMV6-Neo. PCR em tempo real, western blot e imunofluorescência foram utilizados para caracterizar os clones de células com expressão de SPARC. A taxa proliferativa não foi alterada de forma significativa pela expressão de SPARC. No entanto, observou-se um aumento da sensibilidade ao docetaxel em células MCF7 expressando SPARC em comparação com as células MCF7 controle sem expressão de SPARC, indicando que a expressão de SPARC tem propriedades de aumentar a quimiosensibilidade em células de câncer de mama. Utilizamos a técnica de cDNA microarray, para avaliar o perfil de expressão de células MCF7 com expressão de SPARC em comparação com células MCF7 sem expressão de SPARC antes e após tratamento com docetaxel 5nM e 100nM por 24h. Identificamos diversos genes potencialmente envolvidos na quimiosensibilidade ao docetaxel mediada por SPARC. Setenta genes mais diferencialmente expressos (expressão aumentada ou reduzida) foram selecionados a partir dos diferentes tratamentos e várias redes moleculares foram identificadas utilizando o Ingenuity Pathway Analysis (IPA). Após anotação gênica seis genes, SPANXA1, ALDH1A3, TPM4, TARP, XAF1, e WNT5A foram selecionados e validados por qPCR. Utilizando análise proteômica quantitativa livre de marcação avaliamos ainda a ocorrência de alterações proteômicas na comparação das células MCF-7 com super-expressão de SPARC antes e após tratamento com docetaxel. Entre as redes de interação molecular, a via de remodelamento de citoesqueleto foi a via mais abundante observada na comparação entre as células MCF-7 com expressão de SPARC e as células controle sem expressão de SPARC antes do tratamento com docetaxel; e a via do metabolismo de GTP foi a via mais abundante observada na comparação entre as células MCF7 com expressão de SPARC e as células controle sem expressão de SPARC após tratamento com docetaxel. Na integração dos dados de transcriptoma e proteoma identificamos quarenta genes diferencialmente expressos pelas duas abordagens, sendo a via WNT representada entre eles. Nossos resultados sugerem que a expressão SPARC pode influenciar a quimiosensibilidade ao Docetaxel em células MCF-7, modulando genes envolvidos em diversos processos biológicos que podem estar relacionados com a sensibilidade a drogas / The SPARC (secreted protein, acidic, cysteine-rich) gene encodes a 42kDa protein that belongs to a family of matricellular proteins, which interact with cell-surface receptors, growth factors and the ECM (extracellular matrix) components. SPARC plays a role in tissue remodeling, cell migration, angiogenesis, embryonic development, tumorigenesis and chemiosensitivity. Docetaxel, which is an antimicrotubulin agent, is an effective chemotherapeutic drug for the treatment of advanced breast cancer. However, a considerable proportion of breast cancer patients do not respond positively to docetaxel. The mechanisms of docetaxel resistance are poorly understood. In a previous study, we identified SPARC as differentially expressed in mammary epithelial cells expressing different levels of HER-2. In the present study, we evaluate the effects of SPARC over-expression on the sensitivity of breast cancer cells to docetaxel. MCF7 cells were transfected with the expression vector pCMV6-SPARC or pCMV6-Neo. Real time PCR, western blot and immunofluorescence were used to characterize the clones over-expressing SPARC. Proliferation was not significantly affected by SPARC over-expression. However, we observed an increased sensitivity to docetaxel when comparing the MCF7 control cells with the MCF7 cells overexpressing SPARC, indicating that SPARC expression has chemosensitive properties in breast cancer cells. We used cDNA microarray to evaluate the expression profile of MCF7 cells with SPARC overexpression in comparison with MCF7 control cells before and after docetaxel treatment for 24h.We have identified several differentially expressed genes potentially involved in SPARC-mediated chemosensibility to docetaxel. Seventy of the highly expressed genes were selected from all treatments and several molecular networks were identified using the Ingenuity Pathway Analysis (IPA). After manual annotation, six genes, SPANXA1, ALDH1A3, TPM4, TARP, XAF1, and WNT5A, potentially associated with SPARC mediated chemiosensitivity were selected and validated by qPCR. Using label-free approach for quantitative proteomic analysis, we further evaluated the proteomic changes in the comparison of the MCF7 cells control and over-expressing SPARC before and after docetaxel treatment. Among the molecular interaction networks, cytoskeleton remodeling pathway was the top pathway map observed in the comparison between MCF7 cells over-expressing SPARC and the control cells before docetaxel treatment and GTP metabolism pathway was the top pathway map observed in the comparison between MCF7 cells over-expressing SPARC and the control cells after docetaxel treatment. Transcriptome and proteome integrated data, resulted in forty commonly up and down regulated genes, being the WNT pathway represented among them. Our findings suggest that SPARC expression can influence Docetaxel sensitivity in MCF7 cells by modulating genes involved in diverse biologic process that might be related to drug sensitivity
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-10062015-101237 |
| Date | 27 March 2015 |
| Creators | Pavanelli, Ana Carolina |
| Contributors | Nagai, Maria Aparecida |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | Dissertação de Mestrado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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