Made available in DSpace on 2016-06-02T19:22:11Z (GMT). No. of bitstreams: 1 5903.pdf: 2922633 bytes, checksum: dfd272eca77563615a9e3fe15f5907c9 (MD5) Previous issue date: 2014-04-10 / Universidade Federal de Minas Gerais / The Locus coeruleus (LC) has been suggested as a CO2 chemoreceptor site in mammals. Most of the studies involving the role of LC in hypercapnic ventilatory response have been performed in males. Since, ovarian steroids modulate the activity of LC neurons and females have a different respiratory response to CO2 of males, we evaluated the activity of LC noradrenergic neurons during normocapnia and hypercapnia in diestrus, ovariectomized (OVX; 0,2 mL/rat of corn oil, s.c., for 3 days) and estradiol-treated ovariectomized (OVX+E2; 10 μg/0,2 mL/rat, s.c., for 3 days) female rats and in intact, orchidectomized (ORX; 0,2 mL/rat of corn oil, s.c., for 7 days), testosterone-treated orchidectomized (ORX+T; 0,25 mg/0,2 mL/rat, s.c., for 7 days) and estradiol-treated orchidectomized (ORX+E2; 10 μg/0,2 mL/rat, s.c., for 3 days) male rats by using double-label immunohistochemistry to c-Fos/TH. Additionally, we assessed the role of noradrenergic LC neurons in OVX and OVX+E2 females on respiratory response to hypercapnia by using 6-hydroxydopamine. Hypercapnia (7% CO2) increased the double-staining (c-Fos/TH-ir) in LC neurons in all groups when compared to air exposure. In the OVX+E2 group there was attenuation in the c-Fos expression in normocapnia and hypercapnia. Hypercapnia increased ventilation in OVX and OVX+E2 groups, which resulted from increases of respiratory frequency (fR) and tidal volume (VT) in sham and 6-OHDA-lesioned groups. The hypercapnic ventilatory response was significantly decreased in 6-OHDA-lesioned rats compared with sham group (29.4% in OVX group and 28.7% in OVX+E2 group) due to a reduced VT in OVX+E2 group and in OVX group due to a decrease in VT and fR. A reduction in TH+ neurons (~61% in OVX and OVX+E2 group) was observed seven days after the microinjections of 6-OHDA in the LC. LC chemical lesion and estradiol did not affect body temperature (Tb). However, hypercapnia caused reduction in Tb of sham (OVX 10 and OVX+E2) and lesioned groups. Thus, we can conclude that noradrenergic neurons in the LC of female and male rats are activated by CO2. However, in OVX+E2 group, estradiol reduced the immunoreactivity compared to OVX group during normocapnia and hypercapnia. Additionally, LC noradrenergic neurons play role in hypercapnic ventilatory response in females but do not affect temperature regulation during normocapnic and hypercapnic conditions. / O Locus coeruleus (LC) é uma área quimiossensível ao CO2 em mamíferos. A maioria dos estudos envolvendo a participação do LC na resposta ventilatória a hipercapnia é realizada em machos. Visto que esteróides ovarianos modulam a atividade de neurônios do LC e fêmeas apresentam uma resposta respiratória ao CO2 diferente de machos, nós avaliamos a atividade dos neurônios noradrenérgicos do LC durante normocapnia e hipercapnia em ratas ciclando em diestro, ovariectomizadas (OVX; 0,2 mL/rata de óleo de milho, s.c., por 3 dias) e ovariectomizadas tratadas com estradiol (OVX+E2; 10 μg/0,2 mL/rata, s.c., por 3 dias) e em ratos intactos, orquidectomizados (ORX; 0,2 mL/rato de óleo de milho, s.c., por 7 dias), orquidectomizados tratados com testosterona (ORX+T; 0,25 mg/0,2 mL/rato, s.c., por 7 dias) e tratados com estradiol (ORX+E2; 10 μg/0,2 mL/rato, s.c., por 3 dias) usando dupla-marcação imunoistoquímica para c-Fos/TH. Adicionalmente, nós avaliamos a participação dos neurônios noradrenérgicos do LC em fêmeas OVX e OVX+E2 na resposta respiratória a hipercapnia usando a neurotoxina 6-hidroxidopamina. A hipercapnia (7% CO2) aumentou a dupla marcação (c-Fos/TH-ir) nos neurônios do LC em todos os grupos comparados a normocapnia. No grupo OVX+E2 houve uma atenuação da expressão de c-Fos no LC em normocapnia e hipercapnia. A hipercapnia causou aumento na ventilação nos grupos OVX e OVX+E2, o qual resultou do aumento da frequência respiratória (fR) e volume corrente (VT) nos grupos controle e lesados. A resposta ventilatória a hipercapnia foi significativamente atenuada no grupo lesado comparado ao grupo controle (29,4% no grupo OVX e 28,7% no grupo OVX+E2) devido à queda no VT no grupo OVX+E2 e no grupo OVX foi devido a queda no VT e na fR. Observamos uma redução de neurônios noradrenérgicos (~61% nos grupos OVX e OVX+E2) sete dias após microinjeções de 6-OHDA no LC. A lesão química do LC e o 8 estradiol não afetaram a Tc. Entretanto, a hipercapnia promoveu redução na temperatura dos grupos sham (OVX e OVX+E2) e lesado. Assim, nós podemos concluir que os neurônios noradrenérgicos do LC de fêmeas e machos são ativados por CO2. Entretanto, no grupo OVX+E2, o estradiol reduziu a imunorreatividade comparado ao grupo OVX durante normocapnia e hipercapnia. Adicionalmente, os neurônios noradrenérgicos do LC de fêmeas participam da resposta ventilatória a hipercapnia, mas não participam da regulação da temperatura durante condições normocápnicas e hipercápnicas.

Made available in DSpace on 2016-06-02T19:22:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2475.pdf: 1572607 bytes, checksum: 64043b30c1df210d393c4540c2d88933 (MD5) Previous issue date: 2009-05-29 / Universidade Federal de Minas Gerais / The locus coeruleus (LC) has been suggested as a CO2 chemoreceptor site in mammals. Substance P (SP) has been used as a marker of respiratory neurons and it plays an important role in compensatory responses to hypercapnia in several sites of the central nervous system. Neurokinin-1 (NK-1) receptor immunoreactive (NK1Rir) neurons and processes are widely distributed within the LC. Thus, the present study assessed the role of NK-1 receptors in the LC in the cardiorespiratory and thermal responses to hypercapnia. To this end, substance P-saporin conjugate (SPSAP; 2μM) was injected in the LC to kill NK1R-ir neurons, or IgG-SAP as a control in male Wistar rats. The animals that the drug reached the fourth ventricle (4ºV) were considered as a 4ºV group. Pulmonary ventilation (VE, body plethysmograph), mean arterial pressure (MAP), heart rate (HR) and body core temperature were measured followed by 60 min of hypercapnic exposure (7% CO2). To verify the correct placement and effectiveness of the chemical lesions, immunohistochemistry for NK1R was performed. In addition, tyrosine hydroxylase (TH) immunoreactivity was performed to verify if noradrenergic neurons were eliminated. Fluoro-Jade technique was used to evaluate neuronal degeneration. A reduced NK1R (72% of reduction) and TH immunoreactivity (66% of reduction) was observed seven days after the injections of SP-SAP in the LC and an intense Fluoro-Jade staining, showing the effectiveness of the lesion. Focal lesions of NK1R-ir did not affect basal ventilation in the SP-SAP in LC and SP-SAP in 4ºV groups. Hypercapnia caused an increase in pulmonary ventilation in all groups, which was a result of increases in respiratory frequency (fR) and tidal volume (VT), SP-SAP treatment in the LC and in the fourth ventricle attenuated the hypercapnic ventilatory response (30% and 20%, respectivally), due to a reduction in the VT. SP-SAP in the LC and SP SAP in the 4ºV 11 lesion did not affect MAP, but caused an increase in HR in both groups. The results suggest that NK1R-ir neurons in the LC modulate hypercapnic ventilatory response but play no role in breathing control under resting conditions. Additionally, NK1R-ir neurons seem to play no role in body temperature and MAP regulation in resting conditions and during hypercapnia, but modulate HR during CO2 exposure. This modulation may be due to a change in the noradrenaline release. / O locus coeruleus (LC) é considerado uma região quimiorreceptora a CO2/pH em mamíferos. A substância P (SP) tem sido usada como marcador de neurônios respiratórios, pois possui importante função nas respostas compensatórias a hipercapnia em muitas áreas do sistema nervoso central. Neurônios e processos imunorreativos a receptores neurocinina 1 (NK-1) estão amplamente distribuídos dentro do LC. Portanto, o presente estudo teve por objetivo avaliar a participação de receptores NK-1 no LC nas respostas cardiorrespiratórias e termorreguladoras à hipercapnia. Para este fim, foi injetado o conjugado SP-Saporina (SP-SAP; 2μM) no LC de ratos Wistar para lesar neurônios que expressam esses receptores, ou IgGSAP como controle. Os animais em que as injeções atingiram o quarto ventrículo (4ºV) foram considerados como grupo 4ºV. A ventilação pulmonar (VE, pletismografia de corpo inteiro), pressão arterial média (PAM), freqüência cardíaca (FC) e temperatura corporal (Tc) foram medidas por 60 min de exposição à hipercapnia (7% CO2). Para verificar a correta localização e efetividade da lesão química realizou-se a imunohistoquímica para receptores NK-1. Além disso, imunohistoquímica para tirosina hidroxilase (TH) foi realizada para averigüar se neurônios noradrenérgicos foram lesados. A técnica de Fluoro-Jade foi também utilizada para avaliar a neurodegeneração. Observou-se a redução da imunorreatividade para receptores NK-1 (72% de lesão dos neurônios) e redução da imunorreatividade para neurônios noradrenérgicos (66% dos neurônios noradrenérgicos) sete dias após injeções de SP-SAP no LC e intensa marcação na técnica de Fluoro-Jade mostrando a efetividade da lesão. Lesões seletivas de neurônios que expressam receptores NK-1 no LC não afetaram a ventilação basal, o mesmo foi observado com os animais em que a injeção atingiu o 4ºV. A hipercapnia causou aumento da ventilação pulmonar 9 em todos os grupos decorrente do aumento da freqüência respiratória (fR) e volume corrente (VC). Entretanto, o tratamento com SP-SAP no LC e no 4ºV promoveu atenuação da resposta ventilatória (30% e 20%, respectivamente), devido à diminuição do VC. A lesão com SP-SAP no LC e no 4ºV não afetou a PAM, entretanto promoveu aumento na FC em ambos grupos. Os resultados sugerem que os neurônios que expressam receptores NK-1 no LC modulam a resposta ventilatória à hipercapnia, porém não possuem papel tônico na ventilação em condições basais. Além disso, esses neurônios não participam da regulação da temperatura e da PAM em normocapnia e hipercapnia, mas modulam FC durante exposição ao CO2. Essa modulação pode ser devida a alteração na liberação de noradrenalina.

O gene SPARC (secreted protein, acidic, cysteine-rich; também denominado de Osteonectina; BM-40) codifica uma proteína de 42kDa, membro de uma família de proteínas matricelular, que interagem com receptores de superfície celular, fatores de crescimento e componentes da matriz extracelular (ECM). SPARC desempenha importante papel no remodelamento de tecidos, migração celular, angiogênese, desenvolvimento embrionário, tumorigênese e quimiosensibilidade. O Docetaxel é um agente anti-microtúbulo pertencente à classe do taxanos, sendo utilizado como uma droga quimioterápica eficaz para o tratamento do câncer da mama avançado. No entanto, é considerável o número de pacientes que não respondem ou adquirem resistência ao tratamento com os taxanos. Os mecanismos envolvidos na resistência ao docetaxel ainda não estão completamente estabelecidos. Em um estudo prévio de nosso grupo, identificamos os transcritos do gene SPARC como diferencialmente expressos em células epiteliais mamárias expressando diferentes níveis de HER-2. No presente estudo, nós avaliamos o efeito da expressão do SPARC na sensibilidade de células de câncer de mama ao Docetaxel. As células MCF-7 foram transfectadas com o vetor de expressão pCMV6-SPARC ou pCMV6-Neo. PCR em tempo real, western blot e imunofluorescência foram utilizados para caracterizar os clones de células com expressão de SPARC. A taxa proliferativa não foi alterada de forma significativa pela expressão de SPARC. No entanto, observou-se um aumento da sensibilidade ao docetaxel em células MCF7 expressando SPARC em comparação com as células MCF7 controle sem expressão de SPARC, indicando que a expressão de SPARC tem propriedades de aumentar a quimiosensibilidade em células de câncer de mama. Utilizamos a técnica de cDNA microarray, para avaliar o perfil de expressão de células MCF7 com expressão de SPARC em comparação com células MCF7 sem expressão de SPARC antes e após tratamento com docetaxel 5nM e 100nM por 24h. Identificamos diversos genes potencialmente envolvidos na quimiosensibilidade ao docetaxel mediada por SPARC. Setenta genes mais diferencialmente expressos (expressão aumentada ou reduzida) foram selecionados a partir dos diferentes tratamentos e várias redes moleculares foram identificadas utilizando o Ingenuity Pathway Analysis (IPA). Após anotação gênica seis genes, SPANXA1, ALDH1A3, TPM4, TARP, XAF1, e WNT5A foram selecionados e validados por qPCR. Utilizando análise proteômica quantitativa livre de marcação avaliamos ainda a ocorrência de alterações proteômicas na comparação das células MCF-7 com super-expressão de SPARC antes e após tratamento com docetaxel. Entre as redes de interação molecular, a via de remodelamento de citoesqueleto foi a via mais abundante observada na comparação entre as células MCF-7 com expressão de SPARC e as células controle sem expressão de SPARC antes do tratamento com docetaxel; e a via do metabolismo de GTP foi a via mais abundante observada na comparação entre as células MCF7 com expressão de SPARC e as células controle sem expressão de SPARC após tratamento com docetaxel. Na integração dos dados de transcriptoma e proteoma identificamos quarenta genes diferencialmente expressos pelas duas abordagens, sendo a via WNT representada entre eles. Nossos resultados sugerem que a expressão SPARC pode influenciar a quimiosensibilidade ao Docetaxel em células MCF-7, modulando genes envolvidos em diversos processos biológicos que podem estar relacionados com a sensibilidade a drogas / The SPARC (secreted protein, acidic, cysteine-rich) gene encodes a 42kDa protein that belongs to a family of matricellular proteins, which interact with cell-surface receptors, growth factors and the ECM (extracellular matrix) components. SPARC plays a role in tissue remodeling, cell migration, angiogenesis, embryonic development, tumorigenesis and chemiosensitivity. Docetaxel, which is an antimicrotubulin agent, is an effective chemotherapeutic drug for the treatment of advanced breast cancer. However, a considerable proportion of breast cancer patients do not respond positively to docetaxel. The mechanisms of docetaxel resistance are poorly understood. In a previous study, we identified SPARC as differentially expressed in mammary epithelial cells expressing different levels of HER-2. In the present study, we evaluate the effects of SPARC over-expression on the sensitivity of breast cancer cells to docetaxel. MCF7 cells were transfected with the expression vector pCMV6-SPARC or pCMV6-Neo. Real time PCR, western blot and immunofluorescence were used to characterize the clones over-expressing SPARC. Proliferation was not significantly affected by SPARC over-expression. However, we observed an increased sensitivity to docetaxel when comparing the MCF7 control cells with the MCF7 cells overexpressing SPARC, indicating that SPARC expression has chemosensitive properties in breast cancer cells. We used cDNA microarray to evaluate the expression profile of MCF7 cells with SPARC overexpression in comparison with MCF7 control cells before and after docetaxel treatment for 24h.We have identified several differentially expressed genes potentially involved in SPARC-mediated chemosensibility to docetaxel. Seventy of the highly expressed genes were selected from all treatments and several molecular networks were identified using the Ingenuity Pathway Analysis (IPA). After manual annotation, six genes, SPANXA1, ALDH1A3, TPM4, TARP, XAF1, and WNT5A, potentially associated with SPARC mediated chemiosensitivity were selected and validated by qPCR. Using label-free approach for quantitative proteomic analysis, we further evaluated the proteomic changes in the comparison of the MCF7 cells control and over-expressing SPARC before and after docetaxel treatment. Among the molecular interaction networks, cytoskeleton remodeling pathway was the top pathway map observed in the comparison between MCF7 cells over-expressing SPARC and the control cells before docetaxel treatment and GTP metabolism pathway was the top pathway map observed in the comparison between MCF7 cells over-expressing SPARC and the control cells after docetaxel treatment. Transcriptome and proteome integrated data, resulted in forty commonly up and down regulated genes, being the WNT pathway represented among them. Our findings suggest that SPARC expression can influence Docetaxel sensitivity in MCF7 cells by modulating genes involved in diverse biologic process that might be related to drug sensitivity

O gene SPARC (secreted protein, acidic, cysteine-rich; também denominado de Osteonectina; BM-40) codifica uma proteína de 42kDa, membro de uma família de proteínas matricelular, que interagem com receptores de superfície celular, fatores de crescimento e componentes da matriz extracelular (ECM). SPARC desempenha importante papel no remodelamento de tecidos, migração celular, angiogênese, desenvolvimento embrionário, tumorigênese e quimiosensibilidade. O Docetaxel é um agente anti-microtúbulo pertencente à classe do taxanos, sendo utilizado como uma droga quimioterápica eficaz para o tratamento do câncer da mama avançado. No entanto, é considerável o número de pacientes que não respondem ou adquirem resistência ao tratamento com os taxanos. Os mecanismos envolvidos na resistência ao docetaxel ainda não estão completamente estabelecidos. Em um estudo prévio de nosso grupo, identificamos os transcritos do gene SPARC como diferencialmente expressos em células epiteliais mamárias expressando diferentes níveis de HER-2. No presente estudo, nós avaliamos o efeito da expressão do SPARC na sensibilidade de células de câncer de mama ao Docetaxel. As células MCF-7 foram transfectadas com o vetor de expressão pCMV6-SPARC ou pCMV6-Neo. PCR em tempo real, western blot e imunofluorescência foram utilizados para caracterizar os clones de células com expressão de SPARC. A taxa proliferativa não foi alterada de forma significativa pela expressão de SPARC. No entanto, observou-se um aumento da sensibilidade ao docetaxel em células MCF7 expressando SPARC em comparação com as células MCF7 controle sem expressão de SPARC, indicando que a expressão de SPARC tem propriedades de aumentar a quimiosensibilidade em células de câncer de mama. Utilizamos a técnica de cDNA microarray, para avaliar o perfil de expressão de células MCF7 com expressão de SPARC em comparação com células MCF7 sem expressão de SPARC antes e após tratamento com docetaxel 5nM e 100nM por 24h. Identificamos diversos genes potencialmente envolvidos na quimiosensibilidade ao docetaxel mediada por SPARC. Setenta genes mais diferencialmente expressos (expressão aumentada ou reduzida) foram selecionados a partir dos diferentes tratamentos e várias redes moleculares foram identificadas utilizando o Ingenuity Pathway Analysis (IPA). Após anotação gênica seis genes, SPANXA1, ALDH1A3, TPM4, TARP, XAF1, e WNT5A foram selecionados e validados por qPCR. Utilizando análise proteômica quantitativa livre de marcação avaliamos ainda a ocorrência de alterações proteômicas na comparação das células MCF-7 com super-expressão de SPARC antes e após tratamento com docetaxel. Entre as redes de interação molecular, a via de remodelamento de citoesqueleto foi a via mais abundante observada na comparação entre as células MCF-7 com expressão de SPARC e as células controle sem expressão de SPARC antes do tratamento com docetaxel; e a via do metabolismo de GTP foi a via mais abundante observada na comparação entre as células MCF7 com expressão de SPARC e as células controle sem expressão de SPARC após tratamento com docetaxel. Na integração dos dados de transcriptoma e proteoma identificamos quarenta genes diferencialmente expressos pelas duas abordagens, sendo a via WNT representada entre eles. Nossos resultados sugerem que a expressão SPARC pode influenciar a quimiosensibilidade ao Docetaxel em células MCF-7, modulando genes envolvidos em diversos processos biológicos que podem estar relacionados com a sensibilidade a drogas / The SPARC (secreted protein, acidic, cysteine-rich) gene encodes a 42kDa protein that belongs to a family of matricellular proteins, which interact with cell-surface receptors, growth factors and the ECM (extracellular matrix) components. SPARC plays a role in tissue remodeling, cell migration, angiogenesis, embryonic development, tumorigenesis and chemiosensitivity. Docetaxel, which is an antimicrotubulin agent, is an effective chemotherapeutic drug for the treatment of advanced breast cancer. However, a considerable proportion of breast cancer patients do not respond positively to docetaxel. The mechanisms of docetaxel resistance are poorly understood. In a previous study, we identified SPARC as differentially expressed in mammary epithelial cells expressing different levels of HER-2. In the present study, we evaluate the effects of SPARC over-expression on the sensitivity of breast cancer cells to docetaxel. MCF7 cells were transfected with the expression vector pCMV6-SPARC or pCMV6-Neo. Real time PCR, western blot and immunofluorescence were used to characterize the clones over-expressing SPARC. Proliferation was not significantly affected by SPARC over-expression. However, we observed an increased sensitivity to docetaxel when comparing the MCF7 control cells with the MCF7 cells overexpressing SPARC, indicating that SPARC expression has chemosensitive properties in breast cancer cells. We used cDNA microarray to evaluate the expression profile of MCF7 cells with SPARC overexpression in comparison with MCF7 control cells before and after docetaxel treatment for 24h.We have identified several differentially expressed genes potentially involved in SPARC-mediated chemosensibility to docetaxel. Seventy of the highly expressed genes were selected from all treatments and several molecular networks were identified using the Ingenuity Pathway Analysis (IPA). After manual annotation, six genes, SPANXA1, ALDH1A3, TPM4, TARP, XAF1, and WNT5A, potentially associated with SPARC mediated chemiosensitivity were selected and validated by qPCR. Using label-free approach for quantitative proteomic analysis, we further evaluated the proteomic changes in the comparison of the MCF7 cells control and over-expressing SPARC before and after docetaxel treatment. Among the molecular interaction networks, cytoskeleton remodeling pathway was the top pathway map observed in the comparison between MCF7 cells over-expressing SPARC and the control cells before docetaxel treatment and GTP metabolism pathway was the top pathway map observed in the comparison between MCF7 cells over-expressing SPARC and the control cells after docetaxel treatment. Transcriptome and proteome integrated data, resulted in forty commonly up and down regulated genes, being the WNT pathway represented among them. Our findings suggest that SPARC expression can influence Docetaxel sensitivity in MCF7 cells by modulating genes involved in diverse biologic process that might be related to drug sensitivity