Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2006. / Submitted by wesley oliveira leite (leite.wesley@yahoo.com.br) on 2009-11-25T16:14:58Z
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Previous issue date: 2006 / As proteínas recombinantes de interesse terapêutico vêm ganhando cada vez mais
espaço na indústria farmacêutica e atualmente já movimentam um mercado anual de cerca
de 50 a 60 bilhões de dólares em todo o mundo. As células de mamíferos são as
hospedeiras de expressão preferencialmente escolhidas no caso de proteínas que requerem
um grau sofisticado de processamento pós-traducional, sendo crescente a iniciativa de identificação de novas linhagens de células, especialmente humanas, como sistemas alternativos de expressão às células utilizadas. Nosso grupo de pesquisa tem interesse na produção de antígenos para seleção de anticorpos com potencial neutralizante, especialmente os antígenos de superfície do envelope viral de HIV-1, agente etiológico da pandemia mundial de AIDS, que atualmente apresenta mais de 40 milhões de infectados. O presente trabalho teve por objetivo a avaliação preliminar das células de ducto de glândula submandibular humana (HSG) como sistema de expressão heteróloga alternativo às células de ovário de hamster chinês (CHO-K1). Comparativamente, foi avaliada a eficiência de transfecção, assim como a de expressão transiente do anticorpo quimérico anti-Z-DNA
Z22, na forma recombinante de fragmento FvFc pelas duas linhagens celulares. Outro
objetivo foi a produção de versões recombinantes das glicoproteínas virais de HIV-1. Os resultados apontaram as células HSG como um bom sistema alternativo para a
produção de proteínas heterólogas secretadas, especialmente quando transfectadas por co-precipitação com fosfato de cálcio, sendo ainda necessários alguns ajustes, uma vez que os choques osmóticos com glicerol e DMSO, considerados pontencializadores da transfecção,
mostraram-se tóxicos da forma como foram executados. Foram amplificados e clonados em
vetor de expressão para células de mamíferos os segmentos gênicos correspondentes a
quatro versões recombinantes das glicoproteínas do envelope viral de HIV-1 (gp160, gp140, gp120 e gp41+PS), subtipo C que, de acordo com as nossas análises, utiliza CCR5 como co-receptor. Até o presente momento, não foi possível a detecção das glicoproteínas recombinantes, expressas de forma transiente em células CHO-K1, sendo necessários ajustes, principalmente na etapa de transfecção. _______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Recombinant therapeutic proteins have become more and more important in the
pharmaceutical industry, and nowadays they are responsible for an injection of about 50 to 60 million dollar a year into the worldwide market. Animal cell cultures are the preferential expression systems for those proteins which require extensive posttranslational modifications. In this view, the identification of alternative expression systems is an issue of increasing concern, specially considering human cell lines. Our research group has been
interested in the production of antigens to be used for the selection of neutralizing
antibodies, particularly those antigens derived from the envelope surface of HIV-1, the etiologic agent of the pandemic infection of AIDS, which nowadays affects more than 40 million people. This work aimed the preliminary evaluation of the human salivary gland duct cells (HSG) as a heterologous expression system alternative to the Chinese hamster ovary cells (CHO-K1). The transfection efficiency for both cell lines was comparatively evaluated, as well as the transient expression of the anti-Z-DNA Z22 chimeric antibody, as a
recombinant FvFc fragment. Another objective was the production of recombinant versions
of HIV-1 glycoproteins. Our results pointed out to the HSG cells as a good alternative system for the production of secreted heterologous proteins, specially when transfected by co-precipitation with calcium phosphate. Some adjusts are still needed, considering that the glycerol and DMSO osmotic shocks, generally considered as transfection pontentializers, proved to be
toxic in the employed protocol. The genic fragments corresponding to four recombinant
versions of the HIV-1 envelope glycoproteins (gp160, gp140 gp120 and gp41+PS), subtype
C, were amplified and cloned in a mammal cells expression vector. According to our
analysis, this virus subtype uses CCR5 as co-receptor. So far, it was not possible to detect
the recombinant glycoproteins expressed in a transient form in the CHO-K1 cells. In order
to achieve this objective, some adjustments are still necessary, specially concerning the
transfection protocol.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:repositorio.unb.br:10482/3228 |
| Date | January 2006 |
| Creators | Sousa, Thiago Machado Mello de |
| Contributors | Fonseca, Márcio José Poças, Maranhão, Andréa Queiroz |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UnB, instname:Universidade de Brasília, instacron:UNB |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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