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Previous issue date: 2011-06-06 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil. / A dengue é uma doença causada pelo vírus da dengue (DENV1-4). Apesar dos
vários estudos, ainda não existe uma vacina comercialmente disponível. A proteína
do envelope (E) de DENV apresenta-se como o maior componente protéico da
superfície viral. Consequentemente, esta proteína é o principal alvo para a indução
de uma resposta imune protetora, provavelmente baseada em anticorpos
neutralizantes. No presente trabalho, nós avaliamos o potencial protetor de vacinas
de DNA baseadas na proteína E de DENV2. Para isto, foram construídos dois
plasmídeos, pE1D2 e pE2D2, que contêm as sequências que codificam o
ectodomínio da proteína E (domínios I, II e III) ou somente o seu domínio III,
respectivamente, clonadas da montante à sequência que codifica o peptídeo sinal do
ativador de plasminogênio de tecido humano (t-PA). Os dois plasmídeos mediaram à
expressão e secreção das proteínas recombinantes in vitro em células eucarióticas,
detectadas com anticorpos anti-DENV2 e avaliadas por ensaios de
imunofluorescência ou marcação metabólica seguida de imunoprecipitação. Ambas
as vacinas de DNA foram capazes de induzir respostas imunes com produção de
anticorpos neutralizantes em camundongos Balb/c, com títulos mais elevados nos
animais imunizados com o pE1D2. A vacina pE1D2 também se mostrou mais
protetora nos testes de desafio com uma dose letal de DENV2, induzindo 100% de
sobrevivência nos camundongos imunizados, enquanto que 45% dos animais
vacinados com o plasmídeo pE2D2 morreram após a infecção. Além disso, 10% e
65% dos camundongos imunizados com pE1D2 ou pE2D2, respectivamente,
apresentaram morbidade frente ao desafio letal. As vacinas pE1D2 e pE2D2
também foram testadas combinadas com o vírus quimérico YF17D-D2, em um
sistema de dose e reforço ou em imunizações simultâneas. O vírus quimérico
YF17D-D2 foi construído com a substituição dos genes prM e E do vírus vacinal da
febre amarela 17DD pelos genes prM e E de DENV2. A vacina de DNA pE1D2
combinada com a quimera YF17D-D2 induziu altos níveis de anticorpos
neutralizantes nos animais vacinados com os diferentes esquemas de imunização.
Além disso, esses animais apresentaram 100% de sobrevivência frente ao desafio
letal com DENV2, com ausência de qualquer sinal clínico da infecção. O efeito
sinérgico da imunização combinada também foi evidenciado quando combinamos a
vacina pE2D2 e YF17D-D2, que gerou 100% de sobrevivência nos animais
desafiados. A resposta imune celular foi avaliada pela produção de IFN-por células
TCD8+ em ensaios de ELISPOT, evidenciando a ativação destas células nos
animais imunizados com as pE1D2 independente da sua combinação com a
quimera YF17D-D2. Além disso, a análise do perfil fenotípico das células TCD4+ e
TCD8+ mostrou um percentual menor de linfócitos CD62L+ nos animais vacinados
com o pE1D2 isolado ou combinado com o vírus quimérico, indicando que a vacina
de DNA pode influenciar nos processos de ativação das células T. Posteriormente,
foram construídas novas vacinas de DNA que codificam os ectodomínios da proteína
E de DENV1, 3 e 4 (pE1D1, pE1D3 e pE1D4), cuja expressão foi confirmada in vitro,
e que serão testadas futuramente em modelos animais. / Dengue is a disease caused by the dengue virus (DENV1-4). Despite several
studies, no effective vaccine is yet commercially available. The envelope protein (E)
of DENV is the viral surface major protein component, associated with numerous
biological activities. Thus, this protein is the main target for the induction of a
protective immune response based on neutralizing antibodies. In the present study,
we evaluated the potential of DNA vaccines expressing the DENV2 E protein for the
induction of protection. Two plasmids were constructed, pE1D2 and pE2D2, which
contain sequences encoding the ectodomain of the E protein (domains I, II and III) or
only its domain III, respectively, cloned upstream the encoding sequence of the
human tissue plasminogen activator signal peptide (t-PA). Both plasmids mediated
expression and secretion of the recombinant proteins in vitro in eukaryotic cells,
detected with anti-DENV2 antibodies and evaluated by immunofluorescence or
metabolic labeling assay followed by imunopreciptation. Both DNA vaccines were
elicited neutralizing antibodies in Balb/c mice, with the highest antibody titers
detected in animals immunized with the pE1D2. The pE1D2 vaccine was also more
protective in challenge tests with a lethal dose of DENV2, inducing 100% survival in
immunized mice, while 45% of animals vaccinated with the plasmid pE2D2 died after
infection. Furthermore, 10% and 65% of the mice immunized with pE1D2 or pE2D2,
respectively, showed morbidity after virus challenge. The vaccines pE1D2 and
pE2D2 were also tested in combination with the chimeric YF17D-D2 virus, in a prime
and booster system or with simultaneous immunizations. The YF17D-D2 chimeric
virus was previously constructed by replacing the prM and E genes of 17DD yellow
fever vaccinal virus with those from DENV2. The pE1D2 DNA vaccine combined with
the YF17D-D2 chimera induced high levels of neutralizing antibodies in animals
vaccinated with any of the different immunization schedules. Moreover, these
animals showed 100% survival rates against a lethal challenge with DENV2, with no
clinical signs of infection. The synergistic effect of combined immunization was also
evident when we used the pE2D2 DNA vaccine and the YF17D-D2 virus, which
generated 100% survival in challenged animals. The cellular immune response was
evaluated by the production of IFN- by CD8+ T cells in ELISPOT assays, revealing
the activation of these cells in animals immunized with the pE1D2 alone or in
combination with the YF17D-D2 chimera. Furthermore, analysis of the phenotypic
profile of CD4+ and CD8+ T cells showed low percentage of CD62L+ lymphocytes in
animals vaccinated with pE1D2, alone or combined with the chimeric virus, thus
indicating that the DNA vaccine can influence the processes of T cell activation. New
DNA vaccines encoding the ectodomains of DENV1, 3 and 4 of the envelope protein
(pE1D1, pE1D3 and pE1D4) were constructed and the expression of recombinant
proteins was confirmed in vitro. These DNA vaccines will be further tested animal
models.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:www.arca.fiocruz.br:icict/6902 |
| Date | January 2011 |
| Creators | Azevedo, Adriana de Souza |
| Contributors | Moraes, Milton Ozório, Lima, Leila Mendonça, Galler, Ricardo, Bozza, Patrícia, Tanuri, Amilcar, Bonaldo, Myrna Cristina, Bruno, Rafaela Vieira, Alves, Ada Maria de Barcelos |
| Publisher | Instituto Oswaldo Cruz |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Source | reponame:Repositório Institucional da FIOCRUZ, instname:Fundação Oswaldo Cruz, instacron:FIOCRUZ |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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