Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia. Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Pró-Reitoria de Pesquisa de Pós Graduação, Universidade Federal de Ouro Preto. / Submitted by giuliana silveira (giulianagphoto@gmail.com) on 2016-02-19T18:08:21Z
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Previous issue date: 2015 / A busca de peptideos bioativos com potencial capacidade de interacao e modulacao da atividade proteolitica do proteassoma 20S constitui tema de grande interesse em biologia celular. O uso de inibidores de proteassoma ja vem sendo aplicado no tratamento de doencas como o cancer, e varias moleculas encontram-se atualmente em fase de testes clinicos. O presente trabalho teve como objetivos a purificacao do proteassoma 20S e a avaliacao do potencial inibitorio de peptideos sobre a atividade quimotripsina-simile do complexo 20S. Neste intuito duas abordagens distintas foram utilizadas: 1) analise do potencial inibitorio de moleculas analogas ao inibidor de proteassoma PR-11, e 2) obtencao de novos alvos com capacidade de interacao e modulacao da atividade proteassomal por meio de tripsinolise de proteinas sericas. Para purificacao do proteassoma 20S utilizou-se de filtracao molecular e troca ionica, as quais proporcionaram a obtencao de dois perfis distintos do complexo 20S, apos analise por eletroforese unidimensional. A confirmacao das identidades das subunidades do proteassoma e a identificacao de proteinas co-eluidas foram realizadas por espectrometria de massas. Quanto ao potencial inibitorio dos analogos do PR-11, foram selecionados os peptideos F12, G9F12 e I9F12. Esses demonstraram eficacia nas taxas de inibicao da atividade proteolitica do proteassoma 20S com destaque para o F12 o qual foi capaz de inibir em cerca de 70 e 53% a atividade quimotripsina simile, quando utilizado na concentracao de 0,25 e 0,125 ƒÊM respectivamente. Para a identificacao de novos alvos moduladores de atividade do proteassoma, proteinas sericas foram digeridas com tripsina seguido de avaliacao do potencial inibitorio dos peptideos resultantes. Os ensaios de atividade demonstraram cerca de 40 e 10% de inibicao quando os peptideos tripticos totais foram empregados nas concentracoes de 50 ƒÊM e 6,25 ƒÊM, respectivamente. A identificacao dos peptideos tripticos ligantes de proteassoma por espectrometria de massas necessitara de novas abordagens tecnicas para ligacao e recuperacao da fracao peptidica ligada. Os resultados obtidos neste trabalho permitiram concluir que analogos estruturais do PR-11 representam moleculas inibidoras de alta potencia e ainda que a tecnica de tripsinolise serica utilizada, e capaz de fornecer peptideos alternativos para modulacao da atividade proteassomal. ________________________________________________________________________________ / ABSTRACT : The search for bioactive peptides endowed with modulatory capability over the activity of 20S proteasomes is a subject of major interest in cell biology. Proteasome inhibitors have been applied in the treatment of diseases such as cancer, and several new molecules are currently under investigation. This study aimed the purification of the 20S murine proteasome and the evaluation of potential inhibitory peptides over its chymotrypsin-like activity. To accomplish these goals two different approaches were used: 1) analysis of the inhibitory activity of three PR-11 derivatives, and 2) generation of new proteasome target molecules through trypsinolysis of serum proteins. 20S proteasome purification was achieved by gel filtration and ion exchange. These chromatographic steps resulted in two distinct and highly homogeneous 20S complexes as judged by one-dimensional gel electrophoresis. Confirmation of the identities for alpha and beta proteasome subunits and co-eluted proteins was made by mass spectrometry. The inhibitory potential of three PR-11 analogs F12, G9F12 and I9F12 was then evaluated. These PR-11 derivatives proved to be efficient 20S proteasome inhibitors highlighting that F12 was able to inhibit approximately 70 and 53% of the chymotrypsin-like activity when used at a concentration of 0.25 and 0.125 μM respectively. For the identification of new target modulators of proteasome activity, serum proteins were digested with trypsin, followed by evaluation of the inhibitory potency of the resulting peptides. Activity assays showed approximately 40 and 10% inhibition when total tryptic peptides were used at concentrations of 50 and 6.25 μM, respectively. The identification of such novel proteasome ligands by mass spectrometry will require the utilization of new approaches for binding and recovering of the bound peptide fraction. The results of this study indicate that structural analogues of PR-11 represent inhibitory molecules endowed with high potency and serum trypsinolysis may offer alternative molecules for modulating proteasome activity.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:localhost:123456789/6319 |
| Date | January 2015 |
| Creators | Carmo, Simone Gonzaga do |
| Contributors | Castro-Borges, William, Santana, Marcos Aurélio |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UFOP, instname:Universidade Federal de Ouro Preto, instacron:UFOP |
| Rights | Autorização concedida ao Repositório Institucional da UFOP pelo autor, 19/02/2016, com as seguintes condições: disponível sob Licença Creative Commons 4.0, que permite copiar, distribuir e transmitir o trabalho, desde que seja citado o autor e licenciante. Não permite o uso para fins comerciais nem a adaptação desta., info:eu-repo/semantics/openAccess |
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