CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / Um relevante nÃmero de espÃcies vegetais à descrito como plantas produtoras de um fluido leitoso comumente denominado de lÃtex. Nestas espÃcies, o lÃtex à sintetizado e armazenado sob pressÃo em um sistema de canais formados por cÃlulas altamente especializadas denominadas de laticÃferas, em cujos citoplasmas estÃo presentes todas as estruturas eucariontes em meio à Ãgua, borracha e inÃmeras molÃculas, muitas das quais especÃficas deste conteÃdo. Muitos estudos tÃm sugerido que molÃculas produzidas nestes fluidos participam da defesa vegetal. Neste trabalho, o lÃtex de 5 espÃcies foi coletado e processado em laboratÃrio para obtenÃÃo de suas fraÃÃes protÃicas e estas foram avaliadas quanto a atividade sobre fungos fitopatogÃnicos atravÃs de ensaios de inibiÃÃo da germinaÃÃo de esporos e crescimento de hifas. ProteÃnas do lÃtex de C. procera (PLCp), Cryptostegia grandiflora (PLCg) e Carica candamarcensis (P1 G10) apresentaram atividade antifÃngica enquanto que Plumeria rubra (PLPr) e Euphorbia tirucalli (PLEt) nÃo apresentaram atividade sobre qualquer dos fungos avaliados (Colletotrichum gloeosporioides, Fusarium oxysporum, Fusarium solani, Rhizoctonia solani, Neurospora sp. e Aspergillus niger). A atividade inibitÃria das fraÃÃes protÃicas se correlacionou diretamente com a presenÃa de atividade proteolÃtica do tipo cisteÃnica presente nas amostras de PLCp, PLCg e P1G10. A atividade antifÃngica foi aumentada na presenÃa de DTT, um ativador destas proteases e foi diminuÃda ou eliminada quanto Ãs amostras foram prÃ-tratadas com iodoacetamida (IAA), um inibidor especÃfico de proteases cisteÃnicas. AlÃm disso, a atividade antifÃngica foi observada quando papaÃna, uma protease cisteÃnica purificada do lÃtex de Carica papaya foi avaliada, mas tripsina e quimotripsina, duas proteases serÃnicas nÃo apresentaram atividade. AtravÃs de cromatografia em coluna de Mono-S Sepharose acoplada ao sistema de FPLC, uma protease cisteÃnica foi isolada de PLCg. A proteÃna purificada (Cg24-I) apresentou massa molecular de 24,118 KDa. A Cg24-I apresentou atividade proteolÃtica mÃxima em pH 8,0 e foi inibida por IAA e E-64, utilizando azocaseÃna e BANA como substratos, respectivamente. Cg24-I inibiu a germinaÃÃo de F. solani e foi capaz de alterar a permeabilidade das membranas dos esporos na concentraÃÃo de 90 ng/ml. Esse conjunto de resultados sugere que proteinases cisteÃnicas de fluidos laticÃferos participam da defesa das plantas contra fungos fitopatogÃnicos e que o provÃvel mecanismo de aÃÃo destas proteÃnas seja a alteraÃÃo da permeabilidade da membrana plasmÃtica destes microrganismos. A descriÃÃo de atividade antifÃngica de proteases cisteÃnicas oriundas de fluidos laticÃferos nÃo à ainda descrita em detalhes na literatura, sendo este um trabalho com carÃter original. / Canal systems containing secretions, such as latex, are widely disseminated in the plant kingdom. These fluids are chemically complex and exhibit intense metabolism. Despite their origin, latex is the cytoplasm of specialized cells growing intrusively into organized tissues and organs, forming an interconnected network allowing latex exudation immediately after tissue damage. Insecticidal effects of latex proteins have been described, however minor studies were devoted to investigate antifungal activities in latex. In this study proteins extracted from latex of Calotropis procera (Ait.) R.Br (PLCp), Plumeria rubra L.(PLPr), Carica candamarcensis Hook F.(P1 G10), Cryptostegia grandiflora (PLCg), and Euphorbia tirucalli L. (PLEt) were tested for antifungal activity against six phytopathogens (Fusarium solani, F. oxysporium, Aspergilus niger, Rhizoctonia solani, Neurospora sp. and Colletrotricum gloerosporioides). PLCp, PLCg and P1G10 exhibited antifungal activity and PLPr and PLEt were not efetive. Inhibitory activity of the protein fractions correlated with the cysteine-type proteolytic activity found in these fractions. The endogenous proteolytic activity and inhibitory activity on fungal growth were both increased when samples were first activated with DTT, a cysteine proteinase activator. Conversely, pre-treatment of samples with iodoacetamide, an inhibitor of these proteases rendered all samples deficient of both, proteolytic and antifungal activities. Antifungal of activity of cysteine proteinases of latex origin was also confirmed when papain, obtained from latex of Caryca papaya was tested while purified trypsin and chemotrysin, two serine-type proteases were not antifungal. A cysteine proteinase was thus, purified form PLCg by ion exchange chromatography on a Mono-S Sepharose matrix monitored by a FPLC system. The protein, named Cg24-I exhibited molecular mass of 26.118 KDa determined by MALDI spectrometry; maximum of proteolysis at pH 8.0 and inhibited by iodoacetamide and E-64 when assayed with azocazein or BANA as substrates. Cg24-I inhibited germination of F. solani and altered membrane permeability of spores at a minimum concentration of 90 ng/ml. Results present here suggest that cysteine proteinases of laticifer fluids are proteins with antifungal activity capable of damaging spore structure and inhibiting hyphae growth. Reports of antifungal activity of latex proteases are still scarce in literature and this work appears as an important contribution to this field. Furthermore, this work gives important evidence for the multiple defensive role of latex in plants.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:www.teses.ufc.br:5552 |
| Date | 26 February 2010 |
| Creators | Diego Pereira de Souza |
| Contributors | MÃrcio Viana Ramos, ClÃverson Diniz Teixeira de Freitas, Carlos Edmundo Salas Bravo |
| Publisher | Universidade Federal do CearÃ, Programa de PÃs-GraduaÃÃo em BioquÃmica, UFC, BR |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Format | application/pdf |
| Source | reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da UFC, instname:Universidade Federal do Ceará, instacron:UFC |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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