CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / A detecÃÃo de inibidores de proteinases cisteÃnicas em raÃzes de feijÃo-de-corda [Vigna unguiculata (L.) Walpers] bem como o acÃmulo de fraÃÃes ricas nestes inibidores por meio de precipitaÃÃo com sulfato de amÃnio seguida de cromatografia lÃquida de fase reversa foram realizados no presente trabalho. FraÃÃes contendo os maiores nÃveis de atividade de inibidores de proteinases cisteÃnicas foram selecionadas e sujeitas à avaliaÃÃo de sua habilidade em suprimir a mobilidade de juvenis de segundo estÃgio (J2) do nematÃide das galhas Meloidogyne javanica, raÃa 1. Em adiÃÃo o efeito nematicida destas tambÃm foi avaliado. Quanto ao parÃmetro mobilidade, a fraÃÃo F 30/60 precipitada com sulfato de amÃnio, numa dose de 40 Âg de proteÃnas, mostrou ser a mais potente de todas as amostras testadas, Ãs 24 h de incubaÃÃo. No entanto, com relaÃÃo à mortalidade ambos os picos PIHPLC e PIIHPLC, obtidos dos passos de HPLC, foram os mais ativos causando um percentual de mortes de nematÃides de 95,0 e 94,7 %, respectivamente, quando as doses mais potentes destes picos foram comparadas. AlÃm disso, a fraÃÃo F 30/60 acoplada a FITC foi usada em experimentos de microscopia de luz-fluorescÃncia para responder as seguintes questÃes: 1) Estariam os efeitos observados sobre a mobilidade e mortalidade relacionados à ligaÃÃo das proteÃnas no nematÃide? e 2) Se sim, esta interaÃÃo à realizada com a superfÃcie do nematÃide ou seu intestino, ou com ambas estruturas? A fraÃÃo F 30/60 parece ser incorporada pelos juvenis e ligar-se especificamente à regiÃo correspondente ao intestino dos nematÃides Ãs 6 h apÃs incubaÃÃo, enquanto que Ãs 24 h apÃs incubaÃÃo o complexo fluorescente parece se dispersar ao longo de todo o corpo do nematÃide, como observado pela microscopia de luz-fluorescÃncia. Estes resultados, somados, sugerem o possÃvel uso dos inibidores presentes em raÃzes de feijÃo-de-corda como ferramentas biolÃgicas potenciais no controle do nematÃide das galhas, M. javanica. / Detection of cysteine proteinase inhibitors in cowpea[Vigna unguiculata(L.) Walpers] roots as well as the accumulation of inhibitors enriched fractions throughammonium sulfate precipitation followed by reversed-phase liquid chromatography were in this present work accomplished. Fractions containing higher levels of cysteine proteinase inhibitor activity were selected and subjected to evaluation of its ability of to suppress the mobility of second stage juveniles (J2) of the root-knot nematode Meloidogyne javanica, race 1. In addition, the nematicidal effect of these fractions was also tested. When the mobility parameter was analyzed the ammonium sulfate precipitated F 30/60 fraction, at a dose of 40 μg of proteins, it shown to be the most potent of all tested samples at 24 h after incubation. However, regarding to mortality the both picks, PIHPLC and PIIHPLC, obtained from the HPLC step were the more actives causing a percentage of killing nematodes of 95.0 % and 94.2 %, respectively when the most potent doses of these picks were compared. Moreover, FITC-coupled F 30/60 fraction was used in light-flu orescence microscopy experiments in order to answer the following basic questions: 1) the observed effects on mobility and mortality will be related to the binding of the proteins in the nematode? And 2) If yes, this interaction is performed with the gut or surface nematode, or yet in the both structures? F 30/60 fraction appears to be incorporated by juveniles and specifically bind to the region corresponding to the gut of nematodes at 6 h after incubation, while at 24 h after incubation the fluorescent complex appears to be widespread along the whole body of the nematode, as observed by light-fluorescence microscopy. These results, all together, suggest the possible use of the inhibitors present in cowpea roots as a potential biological tool in the control of the root-knot nematode, M. javanica.

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / Um relevante nÃmero de espÃcies vegetais à descrito como plantas produtoras de um fluido leitoso comumente denominado de lÃtex. Nestas espÃcies, o lÃtex à sintetizado e armazenado sob pressÃo em um sistema de canais formados por cÃlulas altamente especializadas denominadas de laticÃferas, em cujos citoplasmas estÃo presentes todas as estruturas eucariontes em meio à Ãgua, borracha e inÃmeras molÃculas, muitas das quais especÃficas deste conteÃdo. Muitos estudos tÃm sugerido que molÃculas produzidas nestes fluidos participam da defesa vegetal. Neste trabalho, o lÃtex de 5 espÃcies foi coletado e processado em laboratÃrio para obtenÃÃo de suas fraÃÃes protÃicas e estas foram avaliadas quanto a atividade sobre fungos fitopatogÃnicos atravÃs de ensaios de inibiÃÃo da germinaÃÃo de esporos e crescimento de hifas. ProteÃnas do lÃtex de C. procera (PLCp), Cryptostegia grandiflora (PLCg) e Carica candamarcensis (P1 G10) apresentaram atividade antifÃngica enquanto que Plumeria rubra (PLPr) e Euphorbia tirucalli (PLEt) nÃo apresentaram atividade sobre qualquer dos fungos avaliados (Colletotrichum gloeosporioides, Fusarium oxysporum, Fusarium solani, Rhizoctonia solani, Neurospora sp. e Aspergillus niger). A atividade inibitÃria das fraÃÃes protÃicas se correlacionou diretamente com a presenÃa de atividade proteolÃtica do tipo cisteÃnica presente nas amostras de PLCp, PLCg e P1G10. A atividade antifÃngica foi aumentada na presenÃa de DTT, um ativador destas proteases e foi diminuÃda ou eliminada quanto Ãs amostras foram prÃ-tratadas com iodoacetamida (IAA), um inibidor especÃfico de proteases cisteÃnicas. AlÃm disso, a atividade antifÃngica foi observada quando papaÃna, uma protease cisteÃnica purificada do lÃtex de Carica papaya foi avaliada, mas tripsina e quimotripsina, duas proteases serÃnicas nÃo apresentaram atividade. AtravÃs de cromatografia em coluna de Mono-S Sepharose acoplada ao sistema de FPLC, uma protease cisteÃnica foi isolada de PLCg. A proteÃna purificada (Cg24-I) apresentou massa molecular de 24,118 KDa. A Cg24-I apresentou atividade proteolÃtica mÃxima em pH 8,0 e foi inibida por IAA e E-64, utilizando azocaseÃna e BANA como substratos, respectivamente. Cg24-I inibiu a germinaÃÃo de F. solani e foi capaz de alterar a permeabilidade das membranas dos esporos na concentraÃÃo de 90 ng/ml. Esse conjunto de resultados sugere que proteinases cisteÃnicas de fluidos laticÃferos participam da defesa das plantas contra fungos fitopatogÃnicos e que o provÃvel mecanismo de aÃÃo destas proteÃnas seja a alteraÃÃo da permeabilidade da membrana plasmÃtica destes microrganismos. A descriÃÃo de atividade antifÃngica de proteases cisteÃnicas oriundas de fluidos laticÃferos nÃo à ainda descrita em detalhes na literatura, sendo este um trabalho com carÃter original. / Canal systems containing secretions, such as latex, are widely disseminated in the plant kingdom. These fluids are chemically complex and exhibit intense metabolism. Despite their origin, latex is the cytoplasm of specialized cells growing intrusively into organized tissues and organs, forming an interconnected network allowing latex exudation immediately after tissue damage. Insecticidal effects of latex proteins have been described, however minor studies were devoted to investigate antifungal activities in latex. In this study proteins extracted from latex of Calotropis procera (Ait.) R.Br (PLCp), Plumeria rubra L.(PLPr), Carica candamarcensis Hook F.(P1 G10), Cryptostegia grandiflora (PLCg), and Euphorbia tirucalli L. (PLEt) were tested for antifungal activity against six phytopathogens (Fusarium solani, F. oxysporium, Aspergilus niger, Rhizoctonia solani, Neurospora sp. and Colletrotricum gloerosporioides). PLCp, PLCg and P1G10 exhibited antifungal activity and PLPr and PLEt were not efetive. Inhibitory activity of the protein fractions correlated with the cysteine-type proteolytic activity found in these fractions. The endogenous proteolytic activity and inhibitory activity on fungal growth were both increased when samples were first activated with DTT, a cysteine proteinase activator. Conversely, pre-treatment of samples with iodoacetamide, an inhibitor of these proteases rendered all samples deficient of both, proteolytic and antifungal activities. Antifungal of activity of cysteine proteinases of latex origin was also confirmed when papain, obtained from latex of Caryca papaya was tested while purified trypsin and chemotrysin, two serine-type proteases were not antifungal. A cysteine proteinase was thus, purified form PLCg by ion exchange chromatography on a Mono-S Sepharose matrix monitored by a FPLC system. The protein, named Cg24-I exhibited molecular mass of 26.118 KDa determined by MALDI spectrometry; maximum of proteolysis at pH 8.0 and inhibited by iodoacetamide and E-64 when assayed with azocazein or BANA as substrates. Cg24-I inhibited germination of F. solani and altered membrane permeability of spores at a minimum concentration of 90 ng/ml. Results present here suggest that cysteine proteinases of laticifer fluids are proteins with antifungal activity capable of damaging spore structure and inhibiting hyphae growth. Reports of antifungal activity of latex proteases are still scarce in literature and this work appears as an important contribution to this field. Furthermore, this work gives important evidence for the multiple defensive role of latex in plants.

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / O pinhÃo manso (Jatropha curcas L) à uma planta oleaginosa com grande potencial para a produÃÃo de biocombustÃvel devido à riqueza de lipÃdios existente em suas sementes. Portanto, à uma fonte potencial de Ãleo renovÃvel que tem recebido considerÃvel atenÃÃo da comunidade cientÃfica. O objetivo deste estudo foi fazer uma anÃlise da expressÃo gÃnica de proteinases cisteÃnicas relacionadas à morte celular programada (MCP) em sementes em desenvolvimento e durante a germinaÃÃo de pinhÃo manso, no intuito de conhecer melhor o transcriptoma dos principais genes envolvidos no processo de MCP e durante a deposiÃÃo de proteÃnas de reservas durante a maturaÃÃo das sementes de pinhÃo manso. Para quantificar com acurÃcia os nÃveis de expressÃo gÃnica por RT-qPCR foi necessÃrio realizar uma seleÃÃo de genes de referÃncia (genes constitutivos). Os genes constitutivos escolhidos para esse estudo foram: GliceraldeÃdo-3-fosfato desidrogenase (GAPDH), Poliubiquitina (PUB), alfa-tubulina (TA2), proteÃna fosfatase 2-A (PP2A2), fator de alongaÃÃo-alfa (EF1-α) e actina, todos eles citados e escolhidos na literatura para estudo de normalizaÃÃo de genes em plantas. AtravÃs do programa geNorm de foi possÃvel mostrar os genes de referÃncia mais estÃveis dentre os seis genes de referÃncia. Nossos resultados apontaram que os genes de referÃncia mais estÃveis ​​para as amostras de endosperma e integumento em desenvolvimento foram: GAPDH, PP2A2 e EF1-α e TA2. Os genes de menor estabilidade foram: a actina11; poliubiquitina (PUB). Na germinaÃÃo, os genes mais estÃveis foram GAPDH, PUB e TA2. Entretanto, os genes com menores valores de estabilidade foram a actina, EF1-α e PP2A2. Em nossos estudos, o programa geNorm tambÃm mostrou o nÃmero de genes de referÃncia necessÃrios para a normalizaÃÃo dos dados obtidos por RT-qPCR. Na anÃlise desse estudo, nos mostramos que para as sementes em desenvolvimento, a adoÃÃo de quatro genes mais estÃveis foram GAPDH, PP2A2 e EF1-α e TA2 necessÃrios para normalizaÃÃo dos dados de RT-qPCR. Nos dados de sementes em germinaÃÃo, mostrou-se a adoÃÃo de trÃs genes mais estÃveis ​​(GAPDH, PUB e TA2). Contudo, Para validar nossos resultados com genes de referÃncia, foi usado o perfil padrÃo da expressÃo do gene que expressa a oleosina, na qual mostrou que o padrÃo de expressÃo da oleosina està de acordo com os fornecidos pela literatura, revelando que os genes de referÃncia sÃo eficientes para normalizar os dados obtidos pela RT-qPCR. De posse desses resultados, realizou-se um estudo de expressÃo de genes supostamente envolvidos na morte celular programada e na maturaÃÃo de sementes de pinhÃo manso. Nossos resultados mostraram que os genes com seqÃÃncia C-terminal KDEL: JcCB0580861; JcCA0152821; JcCA0047111 e o gene γ-VPE JCCB0060111 mostraram um altos nÃveis de expressÃo nos estÃgios mais avanÃados em tecidos do integumento e endosperma em sementes de pinhÃo manso em desenvolvimento, e com base em nossas anÃlises, esses genes expressam proteinases cisteÃnicas que estÃo possivelmente envolvidos no processo de MCP. NÃo obstante, os genes que expressam as seguintes VPEs: JcCB0196871; JcCB0244081; e JcCA0012422 de acordo com nossos estudos, provavelmente estÃo envolvidas na maturaÃÃo das proteÃnas de reservas de sementes em desenvolvimento de pinhÃo manso. Esses dados forneceram importantes informaÃÃes a cerca do padrÃo de expressÃo de genes que estÃo envolvidos no transcriptoma de sementes em desenvolvimento, mais precisamente envolvidos no processo de MCP. NÃo obstante, o estudo de normalizaÃÃo e validaÃÃo de genes de referÃncia nos tecidos de integumento e endosperma do pinhÃo manso propiciaram um melhor entendimento no que diz respeito à estabilidade desses genes nas condiÃÃes estudadas. / Jatropha (Jatropha curcas L) is an oilseed plant with great potential for biofuel production because of the wealth of existing lipids in their seeds. Therefore, it is a potential source of renewable oil that has received considerable attention from the scientific community. The objective of this study was to analyze the gene expression of cysteine ​​proteinases related to programmed cell death (PCD) in developing seeds and during germination of Jatropha in order to better understand the transcriptome of the major genes involved in the MCP and during the deposition of protein reserves during maturation of seeds of Jatropha. To accurately quantify the levels of gene expression by RT-qPCR was necessary to make a selection of reference genes (genes constituting). The constituent genes chosen for this study were: Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH), polyubiquitin (PUB), alpha-tubulin (TA2), protein phosphatase 2 A (PP2A2), elongation factor-alpha (EF1-α) and actin, all cited in the literature and were chosen for study standardization of genes into plants. Through the program of geNorm was possible to show the more stable reference genes among the six genes of reference. Our results indicate that the most stable reference genes for samples of the developing endosperm and integument were: GAPDH, PP2A2 and EF1-α and TA2. The genes were less stable: the actina11; polyubiquitin (PUB). In germination, the most stable genes were GAPDH, PUB and TA2. However, genes with lower stability values ​​were actin, EF1-α and PP2A2. In our studies, the geNorm program also showed the number of reference genes needed for normalization of data obtained by RT-qPCR. In the analysis of this study, we show that for the developing seeds, the use of four most stable genes were GAPDH, PP2A2 and EF1-α and TA2 needed for normalization of RT-qPCR data. In the data of germinating seeds, was the adoption of more stable three genes (GAPDH, PUB and TA2). However, To validate our findings with reference genes, we used the standard profile of gene expression which expresses oleosina, which showed that the expression pattern of oleosina is provided according to the literature, genes reveals that the reference are efficient to normalize the data obtained by RT-qPCR. With these results, we carried out a study of expression of genes supposedly involved in programmed cell death and maturation of seeds of Jatropha. Our results showed that genes with sequence C-terminal KDEL: JcCB0580861; JcCA0152821; JcCA0047111 and γ-VPE gene JCCB0060111 showed high levels of expression in later stages in tissues of the integument and endosperm of seeds of Jatropha in developing and Based on our analysis, these genes express cysteine ​​proteinases that are possibly involved in the MCP. Nevertheless, genes that express the following VPEs: JcCB0196871; JcCB0244081, and JcCA0012422 according to our studies, are probably involved in the maturation of protein reserves in developing seeds of Jatropha. These data provided important information about the expression pattern of genes that are involved in the transcriptome of developing seed, more specifically involved in the process of MCP. However, the study of standardization and validation of reference genes in tissues of the integument and endosperm Jatropha provided a better understanding as regards the stability of these genes in the studied conditions