Complex formation between macromolecules constitutes the foundation of most cellular processes. Most known complexes are made up of two or more proteins interacting in order to build a functional entity and therefore enabling activities which
the single proteins could otherwise not fulfill. With the increasing knowledge about
noncoding RNAs (ncRNAs) it has become evident that, similar to proteins, many of
them also need to form a complex to be functional. This functionalization is usually executed by specific or global RNA-binding proteins (RBPs) that are specialized
binders of a certain class of ncRNAs. For instance, the enterobacterial global RBPs
Hfq and ProQ together bind >80 % of the known small regulatory RNAs (sRNAs),
a class of ncRNAs involved in post-transcriptional regulation of gene expression.
However, identification of RNA-protein interactions so far was performed individually by employing low-throughput biochemical methods and thereby hindered the discovery of such interactions, especially in less studied organisms such
as Gram-positive bacteria. Using gradient profiling by sequencing (Grad-seq), the
present thesis aimed to establish high-throughput, global RNA/protein complexome resources for Escherichia coli and Streptococcus pneumoniae in order to provide a
new way to investigate RNA-protein as well as protein-protein interactions in these
two important model organisms.
In E. coli, Grad-seq revealed the sedimentation profiles of 4,095 (∼85 % of
total) transcripts and 2,145 (∼49 % of total) proteins and with that reproduced
its major ribonucleoprotein particles. Detailed analysis of the in-gradient distribution of the RNA and protein content uncovered two functionally unknown
molecules—the ncRNA RyeG and the small protein YggL—to be ribosomeassociated. Characterization of RyeG revealed it to encode for a 48 aa long, toxic protein that drastically increases lag times when overexpressed. YggL was shown to
be bound by the 50S subunit of the 70S ribosome, possibly indicating involvement
of YggL in ribosome biogenesis or translation of specific mRNAs.
S. pneumoniae Grad-seq detected 2,240 (∼88 % of total) transcripts and 1,301
(∼62 % of total) proteins, whose gradient migration patterns were successfully reconstructed, and thereby represents the first RNA/protein complexome resource
of a Gram-positive organism. The dataset readily verified many conserved major
complexes for the first time in S. pneumoniae and led to the discovery of a specific
interaction between the 3’!5’ exonuclease Cbf1 and the competence-regulating ciadependent sRNAs (csRNAs). Unexpectedly, trimming of the csRNAs by Cbf1 stabilized the former, thereby promoting their inhibitory function. cbf1 was further shown
to be part of the late competence genes and as such to act as a negative regulator of
competence. / Makromoleküle, die Komplexe bilden, sind die Grundlage der meisten zellulären
Prozesse. Die meisten bekannten Komplexe bestehen aus zwei oder mehr Proteinen,
die interagieren, um eine funktionelle Einheit zu bilden. Diese Interaktionen ermöglichen Funktionen, die die einzelnen Proteine nicht erfüllen könnten. Wachsende
wissenschaftliche Erkenntnisse über nichtkodierende RNAs (ncRNAs) haben gezeigt, dass, analog zu Proteinen, auch viele ncRNAs Komplexe bilden müssen, um
ihre Funktionen ausüben zu können. Diese Funktionalisierung wird normalerweise von spezifischen oder globalen RNA-bindenden Proteinen (RBPs), die auf eine
bestimmte Klasse an ncRNAs spezialisiert sind, durchgeführt. So binden beispielsweise die in Enterobakterien verbreiteten globalen RBPs Hfq und ProQ zusammen >80 % der bekannten kleinen regulatorischen RNAs (sRNAs)—eine Klasse der
ncRNAs, die in die posttranskriptionelle Genexpressionsregulation involviert ist.
RNA-Protein-Interaktionen wurden bisher anhand einzelner Moleküle und mithilfe von biochemischen Methoden mit niedrigem Durchsatz identifiziert, was
die Entdeckung solcher Interaktionen erschwert hat. Dies gilt insbesondere für
Organismen, die seltener Gegenstand der Forschung sind, wie beispielsweise grampositive Bakterien. Das Ziel dieser Doktorarbeit war es, mittels gradient profiling by sequencing (Grad-seq) globale Hochdurchsatzkomplexomdatensätze der RNA-ProteinInteraktionen in Escherichia coli und Streptococcus pneumoniae zu generieren. Diese
Datensätze ermöglichen es auf eine neue Art und Weise RNA-Protein- und ProteinProtein-Interaktionen in diesen wichtigen Modellorganismen zu untersuchen.
Die E. coli Grad-seq-Daten beinhalten die Sedimentationsprofile von 4095
Transkripten (∼85 % des Transkriptoms) und 2145 Proteinen (∼49 % des Proteoms),
mit denen die wichtigsten Ribonukleoproteine reproduziert werden konnten. Die detaillierte Analyse der Verteilung von RNAs und Proteinen im Gradienten zeigte, dass zwei Moleküle, deren Funktionen bisher unbekannt waren—die ncRNA
RyeG und das kleine Protein YggL—ribosomenassoziiert sind. Durch weitere
Charakterisierung konnte gezeigt werden, dass RyeG für ein toxisches Protein mit
einer Länge von 48 Aminosäuren kodiert, das bei Überexpression die Latenzphase
drastisch verlängert. Für YggL konnte eine Interaktion mit der 50S Untereinheit von
70S Ribosomen nachgewiesen werden, was auf eine potenzielle Funktion in der
Biogenese von Ribosomen oder bei der Translation bestimmter mRNAs hindeutet.
Die S. pneumoniae Grad-seq Daten beinhalten 2240 Transkripte (∼88 % des
Transkriptoms) und 1301 Proteine (∼62 % des Proteoms), deren Migrationsprofile
im Gradienten erfolgreich rekonstruiert werden konnten. Dieser RNA/ProteinKomplexomdatensatz eines grampositiven Organismus ermöglichte erstmalig die
Verifizierung der wichtigsten konservierten Komplexe von S. pneumoniae. Weiterhin
konnte eine spezifische Interaktion der 3’!5’-Exonuklease Cbf1 mit den ciadependent sRNAs (csRNAs), die an der Regulation von Kompetenz beteiligt sind,
nachgewiesen werden. Überraschenderweise stabilisiert das von Cbf1 durchgeführte Kürzen der csRNAs die selbigen, was deren inhibitorische Funktion unterstützt.
Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass cbf1 eines der späten Kompetenzgene
ist und als solches als negativer Regulator der Kompetenz agiert.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:uni-wuerzburg.de/oai:opus.bibliothek.uni-wuerzburg.de:21181 |
| Date | January 2020 |
| Creators | Hör, Jens |
| Source Sets | University of Würzburg |
| Language | English |
| Detected Language | German |
| Type | doctoralthesis, doc-type:doctoralThesis |
| Format | application/pdf |
| Rights | https://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/deed.de, info:eu-repo/semantics/openAccess |
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