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Previous issue date: 2014-08-29 / Universidade Federal de Minas Gerais / The production of second-generation ethanol by enzymatic hydrolysis of biomass is considered a viable and promising alternative to face the global energy crisis and to decrease our dependence on fossil fuels. Therefore, it is necessary to degrade the constituent molecules of the plant cell wall such as lignin, cellulose and hemicellulose to fermentable sugars. However, the use of enzymes for this purpose is still expensive, leading to the increase on studies seeking to make them more feasible economically and technically. The present study aimed the molecular, structural and functional characterization of the endoglucanase Cel12A from the fungus Gloeophyllum trabeum by different techniques. Biochemical data revealed the substrate specificity for the enzyme and showed that β-glucan is the best substrate for its activity (239.2 ± 9.1 U mg-1). Optimal conditions for activity were pH 4.5 and temperature of 50 oC. Thermal stability assay indicated a half-life of 84.6 ± 3.6 hours at 50 oC. The kinetic parameters Km (3.2 ± 0.5 mg mL-1) and Vmax (0,40 ± 0,02 μmol min-1) were determined using β-glucan as substrate. Analysis of scanning electron microscopy of oat spelts and filter paper samples submitted to the hydrolysis by GtCel12A evidenced the degradation effects of these substrates compared to control samples. Moreover, the low-resolution envelope and the crystallographic structure for GtCel12A were determined. The structure revealed a β-sandwich fold with two β-sheets (A and B) and three α-helices, while sheet A showed five strands and sheet B nine strands. The comparative analysis of the amino acid sequence and homologous structures prompted us to identify the catalytic residues, Glu142 and Glu227 in the active site of the enzyme. These results are important for understanding and elucidating the enzyme molecular mechanism of action and other glycoside hydrolase family 12 endoglucanases. / A produção de etanol de segunda geração, a partir da hidrólise enzimática da biomassa vegetal é considerada uma alternativa viável e promissora para enfrentarmos a crise energética mundial e diminuirmos a dependência das fontes fósseis de energia. Para isso, é necessário que ocorra a degradação das moléculas constituintes da parede celular como a lignina, a celulose e a hemicelulose a açúcares fermentescíveis. No entanto, a utilização de enzimas para esse fim ainda apresenta um custo elevado, o que tem desencadeado, cada vez mais, estudos que busquem torná-las mais viáveis econômica e tecnicamente. O presente estudo visou à caracterização molecular, estrutural e funcional da endoglucanase Cel12A do fungo Gloeophyllum trabeum por diferentes técnicas. Os dados bioquímicos revelaram a especificidade por substratos da enzima, sendo que o melhor substrato para a atividade foi o β-glucano (239,2 ± 9,1 U mg-1). As condições ótimas para a atividade foram pH 4,5 e temperatura de 50 oC. Os ensaios de estabilidade térmica indicaram uma meia-vida de 84,6 ± 3,6 horas a 50 oC. Os parâmetros cinéticos Km (3,2 ± 0,5 mg mL-1)) e Vmax (0,40 ± 0,02 μmol min-1) foram determinados utilizando-se β-glucano como substrato. Análises de microscopia eletrônica de varredura de amostras de papel de filtro e aveia submetidos à hidrólise pela GtCel12A evidenciaram os efeitos de degradação dos substratos em relação às amostras controle. Adicionalmente, o envelope de baixa resolução e a estrutura cristalográfica da GtCel12A foram obtidos. O modelo de alta resolução revelou um enovelamento do tipo sanduíche β, com duas folhas β (A e B) e três hélices α, sendo que a folha A apresentou cinco fitas e a B, nove fitas. Por meio de análises comparativas da sequência de aminoácidos e de estruturas homólogas identificamos os resíduos catalíticos Glu142 e Glu227 no sítio ativo da enzima. Tais resultados são importantes para a elucidação e compreensão do mecanismo molecular de atuação dessa enzima e de outras endoglucanases da família GH12.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:repositorio.ufscar.br:ufscar/272 |
| Date | 29 August 2014 |
| Creators | Miotto, Lis Schwartz |
| Contributors | Polikarpov, Igor |
| Publisher | Universidade Federal de São Carlos, Programa de Pós-graduação em Biotecnologia, UFSCar, BR |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Format | application/pdf |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UFSCAR, instname:Universidade Federal de São Carlos, instacron:UFSCAR |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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