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Previous issue date: 2013 / A detecção do DNA de Leishmania spp, pela Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) e suas variações, surgem como alternativas para o diagnóstico da LVC, por serem métodos altamente sensíveis e específicos. O objetivo deste trabalho foi comparar a PCR e suas variações (Seminested PCR e PCR em tempo real) utilizando amostras de pele e de baço de 60 cães soropositivos (RIFI e ELISA). Os animais foram agrupados considerando a forma clínica, sendo classificados como assintomáticos (CA; n=20), oligossintomáticos (CO; n= 22) e sintomáticos (CS; n= 18). Como controle negativo, foram utilizados fragmentos de três cães não infectados provenientes do canil da UFOP. O diagnóstico parasitológico, utilizado como padrão ouro, foi realizado por meio de duas metodologias: cultivo de aspirado medular em meio de cultura NNN/LIT e pela visualização direta de formas amastigotas do parasito em lâminas com imprints de pele e de baço. As análises moleculares foram realizadas utilizando iniciadores direcionados para a região conservada do minicírculo do kDNA de Leishmania – L150/L152 e LINR4/LIN17/LIN19 para as técnicas de PCRc e snPCR, respectivamente. Na qPCR foram utilizados iniciadores que amplificam o gene da DNA polimerase (DNA pol α) de L. infantum. De acordo com os testes parasitológicos 61,7% das amostras foram positivas. Nos fragmentos de pele, a sensibilidade da PCRc foi de 89,2%, já para a snPCR e qPCR foi de 86,5% e 97,3% respectivamente. VPP para a PCRc foi de 36,0%, snPCR de 35,3% e da qPCR foi 38,1%. O VPN foi de 93,6%, 92,1% e 98,3% pelas técnicas de PCRc, snPCR e qPCR respectivamente. Em amostras de baço, a sensibilidade da PCRc foi 81,1%, snPCR de 94,6% e de 100,0% pela qPCR. O VPP para a PCRc foi 33,9%, snPCR 37,4% e qPCR 38,7%. O VPN da PCRc foi de 89,3%, snPCR 96,7% e qPCR 100,0%. A positividade nos testes moleculares aumentou de acordo com a gravidade dos sinais clínicos. Foi observado que a qPCR apresentou os melhores resultados na pele e no baço devido a maior sensibilidade, VPP e VPN, em comparação as outras técnicas moleculares. Sendo assim, concluímos que a melhor técnica e tecido para o diagnóstico molecular da LVC é a qPCR de pele, devido à elevada sensibilidade e fácil obtenção da amostra biológica. ____________________________________________________________________________________ / ABSTRACT: The detection of Leishmania DNA based on polymerase chain reaction (PCR) and its variations represent alternatives for CVL diagnosis with highly sensitive and specific methods. The aim of this work was to compare the PCR and its variations (Seminested PCR and quantitative PCR) in samples of skin and spleen of 60 seropositive dogs (IFAT and ELISA). The animals were divided according to their clinical presentation and were classified as asymptomatic (CA, n = 20), oligosymptomatic (CO, n = 22) and symptomatic (CS, n = 18). As a negative control, we used fragments of three uninfected dogs from the kennel of UFOP. The parasitological diagnosis used as gold standard was performed by two methods: culture of bone marrow aspirate in culture medium NNN/LIT and direct visualization of amastigotes of the parasite on slides with imprints of skin and spleen. The primers L150/L152 and LINR4/LIN17/LIN19 were used to amplify the conserved region of the Leishmania kDNA minicircle in the cPCR and snPCR and qPCR were performed out using the DNA polymerase gene (DNA pol α) primers from L. infantum. According to the parasitological test 61.7% the samples were positive. In skin samples, the sensitivity of cPCR was 89.2%, snPCR was 86.5% and qPCR was 97.3%. PPV for cPCR was 36.0%, snPCR was 35.3% and qPCR was 38.1%. The NPV was 93.6%, 92.1% and 98.3% by the techniques of cPCR, snPCR and qPCR. In spleen samples, the sensitivity of cPCR was 81.1%, snPCR was 94.6% and qPCR was 100.0%. PPV for cPCR was 33.9%, snPCR was 37.4% and qPCR was 38.7%. NPV for cPCR was 89.3%, snPCR was 96.7% and qPCR was 100.0%. Positivity in molecular tests increased with the progression of clinical signs. It was observed that the qPCR showed the best results in skin and spleen due to higher sensitivity, PPV and NPV compared to other molecular techniques. Thus, we conclude that the best technique and tissue for molecular diagnosis of CVL is the qPCR skin due to the high sensitivity and easy obtaining the biological sample.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:localhost:123456789/3364 |
| Date | January 2013 |
| Creators | Reis, Levi Eduardo Soares |
| Contributors | Reis, Alexandre Barbosa, Vital, Wendel Coura |
| Publisher | Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas. CIPHARMA, Escola de Farmácia, Universidade Federal de Ouro Preto. |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UFOP, instname:Universidade Federal de Ouro Preto, instacron:UFOP |
| Rights | A concessão da licença deste item refere-se ao termo de autorização impresso assinado pelo autor com as seguintes condições. Na qualidade de detentor dos direitos autorais, de acordo com a lei nº 9610/98 autorizo a Universidade Federal de Ouro Preto/ UFOP, a disponibilizar gratuitamente, sem ressarcimento dos direitos autorais, o texto integral da publicação supracitada, em meio eletrônico, na BDTD - Biblioteca Digital de Teses e Dissertações e no Repositório Institucional da UFOP, no formato especificado, para fins de leitura, impressão e/ou download pela Internet, a título de divulgação da produção científica gerada pela Universidade a partir desta data., info:eu-repo/semantics/openAccess |
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