Nos últimos anos o aumento na incidência de candidose superficial e invasiva causada por
espécies emergentes resistentes tem sido atribuído a disseminação do uso de antibióticos e
agentes imunossupressores. O aumento de Candida não-albicans deve-se ao incremento de
pacientes imunodeprimidos, neutropênicos, recém nascidos de baixo peso, procedimentos
invasivos e iatrogenia. Todos esses fatores permitem que agentes pouco virulentos, causem
doenças. Vários estudos bioquímicos e moleculares foram realizados no sentido de elucidar as
causas da resistência a antifúngicos em leveduras. Os objetivos do presente estudo foram:
estudar leveduras do gênero Candida isoladas da cavidade bucal de pacientes com e sem HIV;
comparação de métodos de identificação dos isolados; determinar o perfil de sensibilidade aos
antifúngicos anfotericina B e fluconazol pelas metodologias de microdiluição CLSI, AFSTEUCAST
e difusão em agar Etest e obter amostras heterorresistentes à anfotericina B e ao
fluconazol por indução e seleção. Foram identificados 22 isolados de C. albicans, 3 de C.
tropicalis, 3 de C. parapsilosis e 2 de C. glabrata segundo o método clássico. A identificação
por métodos morfológicos e bioquímicos foi 100% concordante com o método molecular
(PCR), tanto pela amplificação dos primers espécies-específicos (C. albicans e C.
dubliniensis) quanto pela comparação do tamanho do fragmento amplificado pelos primers da
região ITS2. A correlação entre a metodologia Etest e os dois métodos de microdiluição foi
alta. Todas as amostras selvagens foram sensíveis a anfotericina B (CIM£2,0μg/mL) e apenas
um isolado (3,33%) de C. tropicalis foi resistente ao fluconazol (CIM³64,0μg/mL por CLSI e
CIM³64,0μg/mL por AFST-EUCAST). Foram selecionadas amostras heteroresistentes
através da pressão seletiva utilizando meio adicionado de fluconazol (8μg/mL) e em seguida
com anfotericina B (1,0μg/mL). A pressão seletiva também foi feita iniciando-se com
anfotericina B e em seguida fluconazol. Paralelamente, as amostras selvagens foram
submetidas à indução de resistência através do cultivo primeiro em concentrações crescentes
de fluconazol (16,0; 32,0; 64,0; 128 e 256mg/mL) e em seguida com anfotericina B (0,5; 1,0;
1,5; 2,0; 2,5 e 3,0mg/mL). Os testes também foram feitos invertendo-se os antifúngicos,
iniciando com anfotericina B e depois fluconazol. Foram obtidas três amostras
heterorresistentes a fluconazol, das quais duas foram por indução (C. glabrata e C. tropicalis)
e uma por seleção (C. tropicalis.). Ambas amostras de C. tropicalis foram originadas de um
mesmo isolado selvagem. Nenhuma amostra mudou seu perfil de sensibilidade para
anfotericina B, apesar de alguns isolados apresentarem capacidade de crescimento em várias
concentrações deste antifúngico (1,0 a 3,0μg/mL). Após cultivos sucessivos em meio livre de
droga, somente a cepa obtida por seleção manteve seu fenótipo de resistência. As cepas
selvagens e suas mutantes apresentaram o mesmo perfil quando comparadas pela amplificação
da região ITS2. Conclui-se que, embora a maior parte das espécies estudadas seja C. albicans
(73,33%) todas as amostras heteroresistentes ao fluconazol obtidas foram Candida nãoalbicans
(10%). As duas cepas mutantes obtidas pelo mesmo isolado inicial possuem,
possivelmente, mecanismos múltiplos e distintos de resistência que, associado ao isolado,
conferem resistência e/ou adaptabilidade à levedura frente ao antifúngico. / In the last years the increase in the incidence of superficial and invasive candidosis caused by
resistant species has been attributed to the use of antibiotics and immunosuppression drugs.
The increase do Candida non-albicans isolate due to the increment of patient
immunocompromised, immunodeficiency virus infection, neutropenic, newly born of low
weight, procedures invasives and iatrogenic. All those factors allow that agents a little
virulent, caused diseases. Several biochemical and molecular studies have been accomplished
for elucidating the causes of resistance in yeasts. The aims of the present research were: to
study yeasts of the gender Candida isolated of the buccal cavity patients with and without
HIV; comparison of methods of identification of isolates ; to determine the sensibility profile
to the amphotericin B and fluconazole antifungals by microdilution methodologies CLSI,
AFST-EUCAST and Etest difusion agar and acquisition of heteroresistent samples to
amphotericin B and to fluconazole by induction and selection experiments. Were
identifications 22 C. albicans, 3 C. tropicalis, 3 C. parapsilosis and 2 C. glabrata through the
classic methods. The identification by morphologic and biochemisth was 100% agreement
with the results obtained by the molecular method (PCR), them by the amplification of the
species with specific primers (C. albicans and C. dubliniensis) as for the comparison of the
size of the fragment amplified by the primers of region ITS2. The correlation among the
methodology Etest and the two microdilution methods (CLSI and AFST-EUCAST) was higth.
All samples wilds were suscetibility to amphotericin B (CIM£2,0μg/mL) and just one isolate
(3,33%) of C. tropicalis was resistent to fluconazole (CIM³64,0μg/mL por CLSI e CIM³
64,0μg/mL por AFST-EUCAST). Resistant strains were obtained by selective pressure using
a medium amended with Fluconazole (8 μg/mL) and after that a medium with Amphothericin
B (1.0 μg/mL). The selective pressure was also performed using Amphothericin B at first
followed by Fluconazole. Similarly, wild samples were submitted to the induction of
resistance by culturing in increasing concentrations of Fluconazole (16.0; 32.0; 64.0; 128 e
256mg/mL) followed by culturing in increasing concentrations of Amphotericin B (0.5; 1.0;
1.5; 2.0; 2.5 e 3.0mg/mL) and, after that, inverting the antifungal agents: Amphotericin B at
first, followed by Fluconazole. Three samples heteroresistant to Fluconazole were obtained,
two of which obtained by induction (C. glabrata and C. tropicalis) and one by selection (C.
tropicalis.). Both C. tropicalis samples were originated from te same wild strain.None sample
chamged its susceptibility profile to amphotericin B, in spite of some isolates that presented
capacity of growth in several concentrations of this antifungals (1,0 a 3,0μg/mL). After
successive cultivations in medium free of drugs, only the sample obtained by selection
maintained your resistance phenotype. The wild samples and their mutants presented the same
profile when compared by the amplification of the region ITS2. In conclusion, although most
of the studied species were C. albicans (73,33%), all the fluconazol-heteroresistant samples
obtained were Candida no-albicans (10%). The two mutant samples obtained from the same
initial isolate possibly possess multiple and different mechanisms of resistance that, associated
to the isolate, confer resistance and/or adaptability to the yeast in front to antifungal. / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:10.254.254.39:tede/750 |
| Date | 13 July 2007 |
| Creators | CLAUDINO, André Luís Ribeiro |
| Contributors | ARIOSA, Marília Caixeta Franco, http://lattes.cnpq.br/3413970389346369, CHAVASCO, Jorge Kleber, GIANNINI, Maria José Soares Mendes, MELHEM, Márcia de Souza Carvalho |
| Publisher | Universidade Federal de Alfenas, Faculdade de Ciências Farmacêuticas, Brasil, UNIFAL-MG, Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Format | application/pdf |
| Source | reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da UNIFAL, instname:Universidade Federal de Alfenas, instacron:UNIFAL |
| Rights | http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/, info:eu-repo/semantics/openAccess |
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