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Previous issue date: 2011 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto de Tecnologia em Imunobiológicos. Rio de Janeiro, RJ, Brasil. / O uso de métodos moleculares tem sido apontado como uma das principais
ferramentas para o diagnóstico de doenças infecciosas. Dentre as técnicas
disponíveis, a PCR em tempo real tem sido uma das mais amplamente utilizadas. A
partir dos achados das inúmeras pesquisas desenvolvidas em virtude da epidemia
de Influenza A H1N1 em 2009, tal metodologia foi preconizada pelo CDC como
sendo a mais eficiente para a confirmação desta patologia na população. A rápida
disseminação da epidemia de 2009, em território Brasileiro, evidenciou a
necessidade de adoção de uma alternativa de teste em âmbito nacional, cujos
custos fossem mais compatíveis com os recursos de que dispõe o Sistema Único de
Saúde (SUS). Esta dissertação buscou estabelecer um protótipo de produto para a
Vigilância epidemiológica de Influenza A H1N1 a partir de uma plataforma de PCR
em Tempo Real, visando contribuir para o estabelecimento de uma rede de
vigilância epidemiológica baseada em ensaios moleculares, com a definição de uma
matriz de extração semiautomatizada e um equipamento para a realização de PCR
em Tempo Real. Este trabalho foi desenvolvido por meio da comparação de
matrizes de extração e de equipamentos de PCR em tempo real dos principais
fornecedores internacionais. A empresa que obteve a melhor avaliação segundo os
critérios descritos foi a Biotools®, por ter apresentado uma proposta competitiva
quanto aos custos das plataformas e insumos necessários, além de um atraente
pacote de transferência de tecnologia. Após a definição dos equipamentos e
insumos, foi iniciada a aferição de um protótipo de modelo nacionalizado de
diagnóstico. Em paralelo, buscou-se ainda a melhoria do desempenho do modelo
brasileiro, com a avaliação de diferentes composições da mistura de reação, tendo
sido também testadas regiões genômicas diferentes daquelas do padrão de
referência para o diagnóstico, além da possibilidade do uso de sondas purificadas.
Com base nos resultados obtidos, observou-se que a extração semiautomatizada e
aquela realizada pelo método manual apresentam um padrão semelhante de
eficiência. Também foi comprovada a capacidade de extração do equipamento,
inclusive em diluições de amostra pura até uma concentração de 1024 vezes, além
da eficiência da purificação de sondas pela técnica de HPLC (High-performance
liquid chromatography). Ficou evidenciada a equivalência da reação de PCR em
tempo real desenvolvida pelo consórcio IBMP/Bio-Manguinhos quando comparada à
reação de PCR em tempo real desenvolvida pelo CDC-EUA, considerado padrão de
referência para o diagnóstico molecular de influenza A H1N1. Concomitantemente, o
modelo de equipamentos da Biotools(Labturbo/Liongene) oferece, como vantagens,
a possibilidade de eliminar a etapa manual de extração indicada pelo protocolo do
CDC, e de agregar ao processo a realização de uma extração semiautomatizada, o
que facilita a execução do protocolo e amplia o quantitativo de amostras que podem
ser examinadas a cada ciclo de trabalho. / Nowadays, molecular tools appear as the main alternatives for diagnosis of
infectious diseases. Among the available techniques, Real Time PCR (RT-PCR) has
been widely used, coupled to extraction matrices. In view of the findings obtained
from several researches conducted due to the Influenza A H1N1 epidemic, this
technique is considered by the CDC as the most efficient method to confirm this
pathology in an affected population. The rapid expansion of the 2009 epidemic in
Brazil evidenced the need of a nationalized alternative diagnostic option, without
requiring materials from international (foreign) suppliers, and that could be costeffective
to Brazilian National Health System (SUS). The present work aimed at the
establishment of a product prototype that could meet such requirements. The choice
of an instrument setting based on the Real Time PCR (RT-PCR) platform contributes
to an epidemiological surveillance network of molecular assays, and enhances Bio-
Manguinhos participation in this field.Other factors that were taken into account
concern the economic viability of such instruments, as well as the respective
installation and validation protocols and clearance by the National Sanitary
Surveillance Agency (ANVISA). According to the aforesaid criteria, the best ranked
supplier was BioTools Company, which presented a competitive proposal for cost of
platform and consumables, as well as an attractive technology transfer proposal.
Different formulations of the reaction mixture were evaluated in order to improve the
test performance. It was found that the Real Time PCR (RT-PCR) assay developed
by the IBMP/Bio-Manguinhos consortium presented a better efficacy than that of the
CDC-USA, which is the reference standard for Influenza A H1N1 molecular
diagnosis. Furthermore, BioTools instruments, which were chosen for the tests, have
the advantage of eliminating the manual extraction step in the CDC protocol and
include a semi-automated extraction, which facilitates the performance and increases
the amount of samples processed (throughput of samples).
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:www.arca.fiocruz.br:icict/6074 |
| Date | January 2011 |
| Creators | Dias, Ronaldo Ferreira |
| Contributors | Krieger, Marco Aurélio, Siqueira, Elena C. C., Couceiro, José Nelson, Britto, Constança, Brindeiro, Patrícia Alvarez |
| Publisher | Instituto de Tecnologia em Imunobiológicos. |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Source | reponame:Repositório Institucional da FIOCRUZ, instname:Fundação Oswaldo Cruz, instacron:FIOCRUZ |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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