El procés de regeneració permet als organismes refer parts o teixits del seu cos que han sofert algun dany. Els discs imaginals de Drosophila melanogaster, primordis larvaris de les estructures adultes, tenen capacitat de promoure processos de cicatrització i proliferació, regenerant el teixit i donant lloc a estructures adultes completament normals. Hem estudiat el perfil d’expressió de discs d’ala a 0, 24 i 72h de regeneració.
Els resultats obtinguts mostren un enriquiment significatiu de l’expressió de Factors de Transcripció lligats a importants vies de senyalització com Wingless (Wg), Notch (N) i Jun N-terminal Kinasa (JNK). Mitjançant la cerca computacional de motius d’unió d’AP-1 (factor de transcripció de la via de la JNK) en els promotors dels gens amb canvis d’expressió, hem descrit els gens diana d’aquesta la via procés durant la regeneració. Entre aquests gens es troba cabut (cbt), l’expressió del qual augmenta durant les primeres 24h i disminueix a les 72h, recuperant els seus nivells basals. Hem confirmat aquests resultats per qRT-PCR i amb tècniques d’hibridació in situ, demostrant a més, que l’increment de l’expressió de cbt està associat a cèl•lules del blastema. També hem comprovat que l’expressió de cbt augmenta per sobreactivació de la via de la JNK en el disc d’ala, tal i com s’havia vist prèviament en embrió. Mitjançant la tècnica EMSA hem validat la unió in vitro de les proteïnes Jun i DFos (que formen el dímer AP-1) a la seqüència predita en el promotor del gen cbt confirmant la regulació directe de la via de la JNK. L’anàlisi de discs mutants per cbt indica que l’expressió d’aquest gen és necessària per al tancament de la ferida i proliferació durant la regeneració.
Cabut (Cbt) és un factor de transcripció Zn finger de la família dels Krüpple like Factors i els seus ortòleg en vertebrats són els gens TGFβ Inducible Early Genes (TIEG). Aquest gen s’ha descrit com a modulador de les vies Dpp i JAK/STAT en el disc d’ala. Una aproximació per descriure les funcions d’un factor de transcripció com Cbt és determinar els seus gens diana. Amb aquest objectiu hem realitzat un ChIP-Seq amb un anticòs contra la proteïna Cbt. Els resultats obtinguts mostren que Cbt es troba localitzat principalment als promotors dels gens. Aquest estudi ha reportat 2060 gens diana de Cbt en el disc d’ala. Les categories funcionals GO associades a aquest grup de gens són: Regulació de la transcripció, cicle cel•lular, desenvolupament dels discs imaginals i desenvolupament neuronal. També hem trobat un enriquiment en gens lligats a vies de senyalització com la JNK, Wg i N. L’anàlisi de les seqüències de les dianes de Cbt i altres estudis publicats apunten els factors Sin3A i GAF com a possibles cofactors de Cbt. Finalment hem analitzat el paper de Cbt en la regulació de la via de N, els resultats obtinguts mostren que Cbt regula positivament la via de N promovent el creixement i la formació del marge Dorso/Ventral del disc d’ala.
Per tal d’establir quins factors de transcripció s’uneixen al promotor de cbt i regulen la seva expressió, hem realitzat un cribratge a gran escala utilitzant la tècnica de Yeast-One-Hybrid, que permet descriure la unió de factors de transcripció a una seqüència concreta. Hem obtingut factors de transcripció lligats al desenvolupament neural, a la segmentació i a la resposta immune amb capacitat d’unir-se al promotor de cbt. Aquestes dades no només ens donen informació sobre la regulació de Cbt sinó que també suggereixen la seva implicació en aquests processos.
En conjunt el nostre treball mostra que Cbt regula el creixement i l’homeòstasi del disc d’ala durant el desenvolupament. I que quan es produeix un dany en aquest teixit l’expressió de Cbt incrementa, de manera depenent de la via de la JNK, per garantir la restauració del teixit perdut. / Regeneration is the ability to rebuild a body part that has been damaged or amputated. Drosophila imaginal discs are able to undergo wound healing and regenerative growth after ablation. Genome-wide expression profiling of regenerating wing discs at 0, 24 and 72 hours after fragmentation have revealed a significant enrichment of transcription factors and chromatin regulators. To identify JNK target genes among the differentially expressed genes we performed a computational search of AP-1 binding sites in the promoter regions of these gens. Among them we identified cabut (cbt), the Drosophila ortholog of TGFβ Inducible Early Genes (TIEG). During regeneration cbt expression is induced between 0 and 24 and down-regulated between 24 and 72 hours, suggesting a tight and controlled mechanism of regulation. qRT-PCR and in situ hybridization experiments confirmed cbt expression changes and highlighted that cbt upregulation is associated to cells located in the blastema region. Moreover the analysis of regenerated cbt mutant discs demonstrated that cbt upregulation is required for wound healing and growth during regeneration.
Cbt is a Zn finger transcription factor related to JNK and Dpp pathways, but few is known about its target genes. In order to identify Cbt target genes in development, we performed a Cbt ChIP-Seq analysis of wing discs from larvae III. This study reveal that Cbt is located mostly in the promoter regions of its target genes. We identified 2060 Cbt target genes which were related to functional categories such imaginal disc development, transcription regulation, neuron development or cell cycle. Furthermore several Cbt target genes were associated to signaling pathways like JNK, Wg or Notch (N). The analysis of cbt targets and previous reports pointed the factors GAF and Sin3A as a possible cofactors of Cbt. Finally, genetic interactions between cbt and N mutants demonstrated that Cbt regulates positively N signaling contributing to growth and Dorso/Ventral wing margin regulation.
Although we have demonstrated that JNK is upstream of cbt, there is no much data available about cbt regulation in normal development. To approach this question we performed a high throughput Yeast-One-Hybrid screening that allowed us to defined factors that bind to cbt proximal promoter. The identified factors were related to immune response, neuron development and segmentation. Our results contributed to decipher cbt regulation network and suggested possible new roles for Cbt.
In summary Cbt regulates growth and homeoastasis of wing disc during development. However in front of injury cbt is upregulated in a JNK dependent manner to ensure complete regeneration.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:TDX_UB/oai:www.tdx.cat:10803/109311 |
| Date | 01 March 2013 |
| Creators | Ruiz Romero, Marina |
| Contributors | Corominas, Montserrat (Corominas Guiu), Universitat de Barcelona. Departament de Genètica |
| Publisher | Universitat de Barcelona |
| Source Sets | Universitat de Barcelona |
| Language | Catalan |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/doctoralThesis, info:eu-repo/semantics/publishedVersion |
| Format | 195 p., application/pdf |
| Source | TDX (Tesis Doctorals en Xarxa) |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess, ADVERTIMENT. L'accés als continguts d'aquesta tesi doctoral i la seva utilització ha de respectar els drets de la persona autora. Pot ser utilitzada per a consulta o estudi personal, així com en activitats o materials d'investigació i docència en els termes establerts a l'art. 32 del Text Refós de la Llei de Propietat Intel·lectual (RDL 1/1996). Per altres utilitzacions es requereix l'autorització prèvia i expressa de la persona autora. En qualsevol cas, en la utilització dels seus continguts caldrà indicar de forma clara el nom i cognoms de la persona autora i el títol de la tesi doctoral. No s'autoritza la seva reproducció o altres formes d'explotació efectuades amb finalitats de lucre ni la seva comunicació pública des d'un lloc aliè al servei TDX. Tampoc s'autoritza la presentació del seu contingut en una finestra o marc aliè a TDX (framing). Aquesta reserva de drets afecta tant als continguts de la tesi com als seus resums i índexs. |
Page generated in 0.0032 seconds