Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ecologia, 2017. / Submitted by Raquel Almeida (raquel.df13@gmail.com) on 2017-07-27T15:39:36Z
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Previous issue date: 2017-08-31 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) e da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (Capes). / O descarte de resíduos plásticos no meio ambiente associado à dependência de insumo petroquímico para produção dos mesmos tem gerado grande preocupação, levando à busca constante pelo desenvolvimento de tecnologias verdes renováveis. Segundo a Plastics Europe, em 2016, 25,8 milhões de toneladas de resíduos de plástico pós-consumo acabaram nos fluxos oficiais de resíduos. Destes, 69,2% foi recuperado através de processos de reciclagem e recuperação de energia, enquanto 30,8% continuaram a ser depositados em aterros sanitários. Uma alternativa a utilização de plásticos derivados de petróleo é a produção de plásticos biodegradáveis, como o PLA -poli(ácido lático)-, pois além de ter tempo de degradação diminuído, é produzido a partir de fontes renováveis em bioprocessos estabelecidos, como exemplo, a fermentação microbiana. Dentre os diferentes microrganismos utilizados no estabelecimento destes bioprocessos, a utilização de leveduras é vantajosa, por produzirem metabólitos, proteínas recombinantes e permitir manipulação gênica para otimização. A levedura metilotrófica Pichia pastoris tem sido bastante utilizada em processos fermentativos por atingir altas densidades celulares e produzir poucos co-produtos. Além disso, esta é capaz de utilizar glicerol como única fonte de carbono, principal resíduo da indústria do biodiesel. Porém, não é capaz de produzir ácido lático, monômero utilizado na síntese de PLA. Assim o presente estudo teve como objetivo a construção de cepas geneticamente modificadas de P. pastoris capazes de produzir ácido lático utilizando glicerol como substrato. Para isto, o gene codificador da enzima lactato desidrogenase bovina (Bos taurus) foi inserido no genoma de P.pastoris, permitindo que a cepa X-33 produzisse ácido lático. Embora P. pastoris seja conhecida por seu metabolismo respiratório, as fermentações em batelada realizadas com baixa oxigenação aumentou a produção de ácido láctico em 20%, indicando que nesta situação o metabolismo fermentativo prevaleceu. Além disso, um novo transportador putativo de lactato de P. pastoris denominado PAS, foi identificado por similaridade de pesquisa com o transportador de lactato de Saccharomyces cerevisiae Jen1p. Ambos os transportadores heterólogos e homólogos, Jen1p e PAS, foram avaliados em uma cepa que já continha atividade LDH. As fermentações em batelada das cepas de P. pastoris com o transportador de lactato foram realizadas em condições aeróbicas seguida por uma fase de oxigênio limitado, nesta a produção de ácido lático foi maior. Os resultados mostraram que a cepa contendo o transportador PAS apresentou o maior rendimento, 0,7 g/g (ácido lático/ glicerol). / The disposal of plastic waste in the environment associated with the dependence of petrochemical input for its production has generated great environmental concern, leading to the constant search for the development of green technologies. According to Plastics Europe, in 2016, 25.8 million tonnes of post-consumer plastic waste ended up in official waste streams. Of these, 69.2% was recovered through recycling and energy recovery processes, while 30.8% continued to be deposited in landfills. An alternative to the use of petroleum-based plastics is the production of biodegradable plastics, such as PLA –poly (lactic acid)-, in addition to having decreased degradation time, it is produced from renewable sources in established bioprocesses, such as microbial fermentation. Among the different microorganisms used in the establishment of these bioprocesses, the use of yeasts is advantageous, because they produce metabolites, recombinant proteins and allow gene manipulation for optimization. The methylotrophic yeast Pichia pastoris has been widely used in fermentative processes because it reaches high cell densities and produces few co-products. In addition, it is able to use glycerol as a unique carbon source, the main residue of the biodiesel industry. However, it is not capable of producing lactic acid, the monomer used in PLA synthesis. Thus the present study had as objective the construction of genetically modified strains of P. pastoris capable of producing lactic acid using glycerol as substrate. For this, the gene encoding bovine (Bos taurus) lactate dehydrogenase enzyme was inserted into the genome of P.pastoris, allowing strain X-33 to produce lactic acid. Batch fermentation of the P. pastoris X-33 strain producing LDHb allowed for lactic acid production in this yeast. Although P. pastoris is known for its respiratory metabolism, batch fermentations were performed with different oxygenation levels, indicating that lower oxygen availability increased lactic acid production by 20 %, pushing the yeast towards a fermentative metabolism. Furthermore, a newly putative lactate transporter from P. pastoris named PAS has been identified by search similarity with the lactate transporter from Saccharomyces cerevisiae Jen1p. Both heterologous and homologous transporters, Jen1p and PAS, were evaluated in one strain already containing LDH activity. Fed-batch experiments of P. pastoris strains carrying the lactate transporter were performed with the batch phase at aerobic conditions followed by an aerobic oxygen-limited phase where production of lactic acid was favored. The results showed that the strain containing PAS presented the highest lactic acid titer, reaching a yield of approximately 0.7 g/g (lactic acid/ glycerol).
Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:repositorio.unb.br:10482/24363 |
Date | 09 June 2017 |
Creators | Lima, Pollyne Bororema Almeida de |
Contributors | Parachin, Nádia Skorupa |
Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
Language | Portuguese |
Detected Language | English |
Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
Source | reponame:Repositório Institucional da UnB, instname:Universidade de Brasília, instacron:UNB |
Rights | A concessão da licença deste item refere-se ao termo de autorização impresso assinado pelo autor com as seguintes condições:Na qualidade de titular dos direitos de autor da publicação, autorizo a Universidade de Brasília e o IBICT a disponibilizar por meio dos sites www.bce.unb.br, www.ibict.br, http://hercules.vtls.com/cgi-bin/ndltd/chameleon?lng=pt&skin=ndltd sem ressarcimento dos direitos autorais, de acordo com a Lei nº 9610/98, o texto integral da obra disponibilizada, conforme permissões assinaladas, para fins de leitura, impressão e/ou download, a título de divulgação da produção científica brasileira, a partir desta data., info:eu-repo/semantics/openAccess |
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