Neste trabalho estão apresentadas novas estratégias para funcionalizar superfícies de ouro baseadas na sustentação de bicamadas lipídicas em superfícies de sensores de imagem por Ressonância de Plasmons de Superfície (SPRi) e a construção de um biosensor para detecção de citocromo c. SPRi é uma técnica ótica de gravimetria em tempo real. Por meio de medidas de variações de índice de refração (n) próximas a uma interface, a adsorção e desorção de moléculas podem ser mensuradas. Inicialmente testamos várias estratégias para encontrar um suporte adequado que se ligasse na superfície de ouro e que oferecesse sustentação e estabilidade para a bicamada de fosfolipídeo biotinilado. Estudos de FT-IR e MEV mostraram que a quitosana facilita a formação de uma bicamada íntegra de fosfolipídeos, de tal modo, que a mesma alcança valores de espessura próximos àqueles previstos, ~ 34,5 Å. Além disso, mostramos que esse sistema apresenta vantagens perante outros modelos, tais como, (poli-lisina/fosfolipídeos) e (tiol hidrofóbico/fosfolipídeo). Utilizando-se o complexo químico biotina/estreptoavidina conseguimos imobilizar o anticorpo anti cit c na bicamada, mantendo-o afastado da superfície de ouro. A construção do biosensor foi acompanhada com experimentos de SPRi. O limite de detecção de citocromo c atingido foi de 10-11mol/L. Um sensor construído somente com BSA e anticorpo anti cit c apresentou sensibilidade semelhante. Esta sensibilidade é em torno de três ordens de grandeza superior aos experimentos de imunoblotting usualmente utilizados para detecção de cit c. A principal limitação deste biosensor, tal como de outros imunoensaios, está intimamente ligada às vantagens e desvantagens dos anticorpos como ferramentas analíticas. / In this work we developed new strategies to functionalize gold surfaces based on the support of lipid bilayers on the surfaces of surface plasmon resonance imaging sensors (SPRi) and the construction of a biosensor for detection of cytochrome c. SPRi is an optical gravimetric real time technique. Through measurements of changes in refractive index (n) in close proximity to an interface, the adsorption and desorption of molecules can be measured. Initially we tested several strategies for finding a suitable medium that would adsorb on the gold surface and also support and stabilize a biotinylated phospholipid bilayer. Studies of FT-IR and SEM showed that chitosan induces the formation of an intact phospholipid bilayer, so that it reaches thickness values close to those expected, ~ 34.5 Å. Furthermore, we showed that this system has advantages in relation to other models, such as (poli-lisine/phospholipids) and (thiol hydrophobic / phospholipid). Using the chemical complex biotin/streptavidin anti cyt c antibody could be immobilized in the bilayer, keeping it away from the gold surface. The construction of the biosensor was accompanied with SPRi experiments. The limit of detection of cytochrome c was achieved from 10-11mol / L. A sensor built only with BSA and anti cyt c showed similar sensitivity. This sensitivity is about three orders of magnitude higher than the immunoblotting experiments commonly used for detection of cyt c. The main limitation of this biosensor, like in other immunoassays, is linked to the advantages and disadvantages of antibodies as analytical tools.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:teses.usp.br:tde-12042011-135130 |
| Date | 16 December 2010 |
| Creators | Rodrigo Matias Trolise |
| Contributors | Mauricio da Silva Baptista, Ana Maria Carmona-Ribeiro, Osvaldo Novais de Oliveira Junior |
| Publisher | Universidade de São Paulo, Ciências Biológicas (Bioquímica), USP, BR |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Source | reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP, instname:Universidade de São Paulo, instacron:USP |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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