Tesis presentada a la Universidad de Chile para optar al grado de Doctora en Bioquímica / Antecedentes: El síndrome de ovario poliquístico (SOP), patología endocrinometabólica,
afecta alrededor del 15% de mujeres en edad fértil, afectando
principalmente la función del ovario, aunque también altera la función de otros
tejidos de importancia reproductiva, como el endometrio. El 70% de las mujeres
con SOP son obesas y entre el 60 – 80 % de ellas presentan resistencia a la
insulina. La obesidad genera un ambiente pro-inflamatorio leve pero crónico,
caracterizado por una alta producción de citoquinas pro-inflamatorias. Además,
adiponectina y TNF-α, marcadores de obesidad, tienen un papel importante en
la sensibilidad y la acción de insulina en los tejidos. Los niveles de adiponectina
(sensibilizador de insulina) disminuyen, mientras que los de TNF-α (regulador
negativo de la vía de la insulina) aumentan en mujeres obesas. Estos cambios
podrían afectar el estado energético del endometrio, tejido que exhibe una
anormal señalización de insulina bajo la condición SOP (ambiente
hiperandrogénico / hiperinsulínico). Objetivo: Evaluar si el ambiente proinflamatorio
representado por TNF-α, afecta la señalización de insulina a través
de una disminución de la señalización de adiponectina o por la inactivación de
IRS1, en endometrios de mujeres obesas con SOP. Metodología: En muestras
de suero provenientes de cuatro grupos de estudio: Delgadas (peso normal),
Delgadas-SOP, Obesas y Obesas-SOP (este último grupo es el único con
hiperinsulinemia / hiperandrogenemia) (n=7 para cada grupo), se determinaron
mediante ELISA los niveles de adiponectina, TNF-α e IL-6. En endometrios provenientes de los cuatro grupos de estudio, se determinó los niveles de
proteína / mRNA de moléculas asociadas a las vías de señalización de TNF-α
(TNF-α, TNFR1, TNFR2, NFκB (p65), IKK, IκB) y adiponectina (adiponectina,
AdipoR1, AdipoR2, APPL1, AMPK) por IHQ / WB y qPCR; además, se evaluó el
ambiente pro-inflamatorio a través de la proteína CD68 y los niveles de IL-6 e
IL-6R, mediante IHQ. Los estudios in vitro se realizaron en cultivos de células
estromales endometriales humanas (líneas T-HESC / St-T1b) bajo condiciones
hiperandrogénicas / hiperinsulínicas, y se determinó el efecto de TNF-α sobre
moléculas asociadas a su vía de señalización y a la vía de adiponectina. Se
analizó además, la participación de NFκB, usando un inhibidor de NFκB (PDCT),
en el efecto de TNF-α sobre la expresión de adiponectina en células St-T1b, por
ICQ / WB; finalmente, se evaluó el efecto de TNF-α sobre los niveles de IRS1
fosforilado en tirosina (activante) o serina (inactivante) y sobre la activación de
quinasas (S6K, JNK, AKT), posiblemente involucradas en la inactivación de
IRS1 en una condición de resistencia a la insulina. Resultados: Se observó una
menor concentración de adiponectina en sueros de Obesas-SOP (p<0,05), no
se observaron cambios en las concentraciones de TNF-α sérica, mientras que
IL-6 aumenta en sueros de Delgadas-SOP y ambos grupos de Obesas versus
Delgadas (p<0,05). A nivel tisular, los niveles de adiponectina disminuyen
(p<0,05) y los de TNF-α aumentan (p<0,001) en endometrios de Obesas-SOP.
El contenido proteico de los receptores de TNF-α son mayores en grupos
Delgadas-SOP y ambos grupos de Obesas (p<0,05); sin embargo, el nivel de TNFR2 y de NFκB nuclear presenta un importante aumento en endometrios de
Obesas-SOP (p<0,001). En relación a IL-6 endometrial, ésta es menor en
Delgadas versus los otros grupos (p<0,05), mientras que su receptor no cambia.
Además, un mayor ambiente pro-inflamatorio se observó en endometrios de
Obesas-SOP versus los otros grupos (p<0,01). Los ensayos in vitro, los cuales
confirman en gran medida lo observado en el modelo ex vivo, muestran que la
condición hiperandrogénica / hiperinsulínica disminuye los niveles de
adiponectina y moléculas asociadas a su vía (APPL1 / AMPK), al igual que el
efecto observado con TNF-α a través de la activación de NFκB (p<0,05).
Además, TNF-α induce la expresión de su propia vía de señalización,
aumentando los niveles de TNFR1 y -2, moléculas que activan NFκB y el
contenido nuclear de NFκB. Por último, TNF-α aumenta la fosforilación en
serina de IRS1 y la activación de S6K, JNK y AKT. Conclusión: En
consecuencia, la obesidad podría afectar la señalización de insulina en el
endometrio, a través del aumento del ambiente pro-inflamatorio y la producción
de TNF-α local, lo que generaría una disminución de la señalización de
adiponectina a través de NFκB y/o una inactivación de IRS1 a través de
S6K/JNK bajo condiciones hiperandrogénicas / hiperinsulínicas, lo que
comprometería el metabolismo energético necesario para el normal
funcionamiento del tejido endometrial, lo que explicaría, en parte, las fallas
reproductivas observadas en endometrios de mujeres obesas e hiperinsulínicas
con SOP / Background: Polycystic ovary syndrome (PCOS), an endocrine-metabolic
disorder, affects about 15% of women of childbearing age, mainly affecting
ovarian function, but also alters the function of other tissues of reproductive
importance, such as the endometrium. Seventy percent of women with PCOS
are obese and between 60 - 80% of them have insulin resistance. Obesity
generates a mild but chronic pro-inflammatory environment, characterized by
high production of pro-inflammatory cytokines. In addition, TNF-α and
adiponectin, obesity markers, have an important role in insulin sensitivity and
action in tissues. In fact, adiponectin level (insulin sensitizer) decreases,
whereas those of TNF-α (negative regulator of insulin pathway) increases in
obese women. These changes could affect the energy state of the endometrium,
tissue exhibiting abnormal insulin signaling under the SOP condition
(hyperandrogenic / hyperinsulinemic environment). Objective: To evaluate
whether the proinflammatory environment represented by TNF-α, affects insulin
signaling through a decrease in adiponectin signaling or inactivation of IRS1, in
endometrium of obese women with PCOS. Methodology: In serum samples
from the four study groups: Lean (normal-weight), Lean-PCOS, Obese and
Obese-PCOS (the latter group is the only one with hyperinsulinemia /
hyperandrogenaemia) (n = 7 for each group) were determined: adiponectin,
TNF-α and IL-6 levels by ELISA. In endometrium from the four study groups,
was determined the levels of protein / mRNA of molecules associated with the signaling pathways of TNF-α (TNF-α, TNFR1, TNFR2, NFκB (p65), IKK, IκB)
and adiponectin molecules (adiponectin, AdipoR1, AdipoR2, APPL1, AMPK) by
IHC / WB and qPCR; additionally, the proinflammatory environment through
CD68 protein and IL-6 / IL-6R levels, was evaluated by IHC. In vitro studies
were conducted in human endometrial stromal cells (lines T-HESC / St-T1b)
under hyperandrogenic / hyperinsulinic conditions, and the effect of TNF-α on
molecule levels associated with its signaling pathway and adiponectin pathway,
was determined by WB. NFκB participation was further analyzed using a NFκB
inhibitor (PDCT) of TNF-α action on adiponectin expression in St-T1b cells by
ICC; finally, it was evaluated the effect of TNF-α on in tyrosine phosphorylated
levels of IRS1 (activating) or serine (inactivating) and kinases activation (S6K,
JNK, AKT), possibly involved in the inactivation of IRS1 in an insulin resistance
condition. Results: A lower concentration of adiponectin in serum from Obese-
PCOS (p <0.05) was observed, no changes were found in serum concentrations
of TNF-α, whereas IL-6 increases in serum from Lean-PCOS and both Obese
groups versus the Lean group (p <0.05). At tissue level, adiponectin content
decreases (p <0.05) and TNF-α increases (p <0.001) in Obese-PCOS
endometrium. The protein content of TNF-α receptors are higher in Lean-PCOS
groups and both Obese groups (p <0.05); however, nuclear NFκB and TNFR2
levels present an important increase in endometrium from Obese-PCOS (p
<0.001). Regarding endometrial IL-6, a lower level in Lean versus the other
groups was observed (p <0.05), while receptor content does not change. In addition, a higher pro-inflammatory environment was observed in Obese-PCOS
endometrium versus the other studied groups (p <0.01). In vitro assays, which
largely confirm what was observed in the ex vivo model, show a decrease of
adiponectin levels and molecules associated with their pathway (APPL1 /
AMPK) under hyperandrogenic / hyperinsulinic conditions, as well as, the effect
observed with TNF-α through NFκB activation (p <0.05). In addition, TNF-α
induces the expression of their own signaling pathway, increasing levels of
TNFR1 and -2, molecules that activate NFκB and nuclear NFκB content. Finally,
TNF-α increases phosphorylated IRS1 levels in serine and activation of S6K,
JNK and AKT. Conclusion: Consequently, obesity may affect insulin signaling
in the endometrium, by increasing the proinflammatory environment and local
production of TNF-α, generating a decrease in adiponectin signaling through
NFκB and / or inactivation of IRS1 through S6K / JNK under hyperandrogenic /
hyperinsulinic conditions, which compromise the energy metabolism necessary
for normal functioning of endometrial tissue. These abnormalities may explain in
part, reproductive failures observed in endometria from obese and hyperinsulinic
women with PCOS / Conicyt; Fondecyt
| Identifer | oai:union.ndltd.org:UCHILE/oai:repositorio.uchile.cl:2250/142460 |
| Date | January 2016 |
| Creators | Oróstica Arévalo, María Lorena |
| Contributors | Vega Blanco, María Margarita |
| Publisher | Universidad de Chile |
| Source Sets | Universidad de Chile |
| Language | Spanish |
| Detected Language | Spanish |
| Type | Tesis |
| Rights | Attribution-NonCommercial-NoDerivs 3.0 Chile, http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/cl/ |
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