Bactéria e fungos são as principais fontes de enzimas envolvidas na transformação de compostos chave para o fluxo de carbono em solos de manguezal, caracterizado por alta prevalência de anaerobiose, salinidade e elevado teor de matéria orgânica. A decomposição de plantas ou resíduos de animais nestas condições é muito lenta, devido à pressão seletiva sobre a evolução de enzimas envolvidas nos processos de mineralização de nutrientes. A metagenômica, permiti o acesso a grande maioria da diversidade microbiana no ambiente, por meio da geração de bibliotecas de clones, o que resulta em um cenário promissor para bioprospecção de novas atividades enzimáticas. Neste estudo, foi relatada a descrição e caracterização de uma nova ?-N-acetil-hexosaminidase (EC 3.2.1.52) da família GH3, envolvida na degradação da matéria orgânica em solo de manguezal contaminado por derramamento de óleo localizado no município de Bertioga-SP, por meio de uma triagem de 12.960 clones metagenômicos. O clone positivo para a atividade celulolítica foi sequenciado e um total de 1.175.586 reads foram gerados com tamanho médio de 198 pb. As sequencias foram trimadas com base na qualidade de índice PHRED >= 30.0, e remoção de sequencias do hospedeiro (E. coli) e do vetor (fosmídeo), originando um contig final com 39.586 Kb. Entre as ORF\'s anotadas a partir do contig gerado, uma sequencia de 1.065 nucleotídeos foi identificada como codificante para a enzima ?-N-acetil-hexosaminidase, evidenciando baixa similaridade (32 %) com as demais encontradas no bancos de dados comparativos. A enzima foi expressa e purificada, onde uma banda isolada foi visualizada por SDS-PAGE com massa molecular prevista de 43 kDa. Por fim, as atividades ótimas da enzima (30 °C; pH 5.0; 0.5 M de NaCl; diminuição de atividade após 3hs de incubação) foram caracterizadas por meio do indicador p-nitrophenol (pNP) ligados aos substratos GlNac, GalNac e Glc. A detecção da enzima por meio da metagenômica, evidenciou que os manguezais são reservatórios de novas enzimas com características diferenciadas e altos potenciais de aplicabilidades biotecnológicas / Bacteria and fungi are major sources of enzymes involved in the transformation of key compounds for the carbon fluxes on mangrove soils, characterized by the high prevalence of anaerobiosis salinity and high content of organic matter. The decomposition of plant or animals residues under these conditions is very slow, acting as a selective pressure on the evolution of enzymes involved in the mineralization process of nutrients. Metagenomics has provided access to the vast majority of the microbial diversity in the environment through the generation of fosmid libraries, resulting in a promising scenario for bioprospection enzymatic activities. In this study, we report the description and characterization of a novel ?-N-acetylhexosaminidase (EC 3.2.1.52) of GH3 family, involved in the degradation of organic matter in mangrove soils contaminated by oil spill located in the city of Bertioga-SP through of a screening of 12.960 metagenomic clones. The positive clone for cellulolytic activitie was sequenced and a total of 1.175.586 reads were generated with measuring size 198 bp. The sequences were trimmed based on the index of quality PHRED >= 30.0 and removing the sequences to host (E. coli) and vector (fosmid) resulting in a contig of 39.586 Kb. Between the anoted ORF\'s from generated contig a sequence of 1.065 nucleotides was identified coding for a ?-N-acetylhexosaminidase showing low similatrity (32 %) with the other found in comparatives databases. The enzyme was expressed and purified where an isolated band can be visualized by SDS-PAGE with molecular mass of 43 kDa. Finally, as optimum activity of the enzyme (30 °C; pH 5.0; 0.5M NaCl; decreased activity after 3 h incubation) were characterized by the indicator p-nitrophenol (pNP) linked to the substrates GlNac, GalNac and Glc. The detection of the enzyme through metagenomics indicated that mangroves are reservoirs of novel enzymes with different characteristics and high potential for biotechnological applicability
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-27012016-141443 |
| Date | 25 August 2015 |
| Creators | Soares Júnior, Fábio Lino |
| Contributors | Azevedo, João Lucio de, Lima, André Oliveira de Souza |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | Tese de Doutorado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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