Humanpathogene Sapoviren gehören zur Familie der Caliciviridae und verursachen vor allem bei Klein¬kindern und Senioren Gastroenteritiden. Die Replikationsstrategie von humanpathogenen Sapoviren ist bislang ungeklärt, da weder ein geeignetes Tiermodell noch ein etabliertes Zellkulturmodell zur Verfügung stehen. Aus diesem Grund sollte die Replikation in einem Säugerzellsystem etabliert werden. Die Ergebnisse der Untersuchungen sollen zu einem besseren Verständnis der Replikationsstrategie der humanpathogenen Sapoviren beitragen und können die Grundlage für weitere Unter¬suchungen der Replikationsstrategie der Caliciviren bilden sowie zur Entwicklung geeigneter antiviraler Maßnahmen und Medikamente beitragen. Für die Untersuchung der Replikationsstrategie des humanpathogenen Sapovirus wurde ein Sapovirus-Volle-Länge-Klon aus Patientenmaterial (Stuhlgang-Probe) generiert. Nach der molekularen Charakterisierung konnte der Stamm Hu/SaV/Dresden/pJG-SapI/2004/DE (GenBank-Zugangsnummer AY694184) der Genogruppe I Genotyp 1 der Sapo¬viren zugeordnet werden. Für die Untersuchung der Translation des humanpathogenen Sapovirus in Säugerzellen wurden polyklonale Antikörper in Kaninchen gegen die nichtstrukturellen und strukturellen Sapovirus-Proteine generiert. Im zellfreien System konnte die Sensitivität und Spezifität dieser Antikörper validiert werden. Außerdem wurde die Translation im zellfreien System mit bereits bestehenden Ergebnissen verglichen. Die Prozessierung des ORF1-Polyproteins erfolgte in die nichtstrukturellen Proteine NS1, NS2, NS3NTPase, NS4, NS5VPg, die Fusionsproteine NS1-3, NS2-3, NS4-5, NS4-7, NS5-7 und NS6 7Pro-Pol sowie das strukturelle Protein VP1. Für die Charakterisierung der Replikation des humanpathogenen Sapovirus in Säugerzellen wurden verschiedene Sapovirus-Volle-Länge-cDNA-Klone generiert. Für das Sapovirus-Volle-Länge-RNA-Genom pJG-SapI-T7 konnte eine Translation der Sapovirus-Proteine nach¬gewiesen werden. Die Transfektion von 293T-Zellen erfolgte mit in vitro transkribierter RNA, die ein Cap-Analogon und einen Poly(A)-Schwanz besaß. Durch die dem Sapovirus-Genom vorangestellte Kozak-Sequenz, welche als Ribosomenbindungsstelle dient, konnte auch nach Mutation des aktiven Zentrums des nichtstrukturellen Proteins NS7Pol (RNA-abhängige RNA-Polymerase) eine Translation des Sapovirus-ORF1-Polyproteins nachgewiesen werden. Somit erwies sich dieses Konstrukt als ungeeignet für die Untersuchung der Replikation des humanpathogenen Sapovirus in Säugerzellen. Nach Klonierung des Sapovirus-Volle-Länge-cDNA-Genoms in den pACYC-MCSII-Vektor (pJG-SapI-T7) konnte nach in vitro Transkription ein gekapptes Sapovirus-Volle-Länge-RNA-Genom mit einem Poly(A)-Schwanz generiert werden, welches vermutlich die richtigen 5’- und 3’-Sapovirus-Enden enthält. Nach Transfektion von 293T-Zellen konnten die nichtstrukturellen Fusionsproteine NS2-3, NS4-5, NS4-7 und NS6-7Pro-Pol sowie das strukturelle Protein VP1 im Western Blot nachgewiesen werden. Nach Mutation des aktiven Zentrums des nichtstrukturellen Proteins NS6Pro (Protease) wurde die Prozessierung des ORF1-Polyproteins in Säugerzellen unter¬bunden. Die Replikation der generierten Sapovirus-Volle-Länge-RNA-Genome in Säugerzellen konnte mit Hilfe der quantitativen PCR nicht nachgewiesen werden. Eine Passagierung in verschiedenen Säugerzelllinien war ebenfalls nicht möglich. Weiter wurden verschiedene Sapovirus-Volle-Länge-RNA-Genome direkt aus Patientenmaterial durch RT-PCR generiert und nach in vitro Transkription damit Säugerzellen transfiziert. Bei Sapovirus-Volle-Länge-RNA-Genomen aus drei Patientenproben konnte die Translation und Prozessierung des Sapovirus-ORF1-Polyproteins nachgewiesen werden. Die Replikation konnte mit Hilfe der quantitativen PCR nicht nachgewiesen werden. In einem letzten Schritt wurde aus Patientenmaterial gewonnene RNA direkt für die Transfektion eingesetzt. Hierfür wurden die Patientenproben verwendet, bei denen eine Translation und Prozessierung des Sapovirus-ORF1-Polyproteines nachgewiesen werden konnte. Auch hier konnte keine Replikation mit Hilfe der quantitativen PCR nachgewiesen werden. In der vorliegenden Arbeit konnte erstmals die erfolgreiche Translation und Prozessierung des ORF1-Polyproteins des humanpathogenen Sapovirus (Dresdner Stamm pJG-SapI, GenBank-Zugangsnummer AY694184) in Säugerzellen gezeigt werden. Weitergehende Untersuchungen zur Replikation des humanpathogenen Sapovirus in Säugerzellen könnten mit Hilfe des vorliegenden Dresdner Sapovirus-Stamm pJG-SapI erfolgen, indem weitere rekombinante Systeme etabliert werden. / The human pathogenic sapovirus belongs to the family of the Caliciviridae and is an important agent of gastroenteritis in infants and the elderly. The replication strategy of the human pathogenic sapovirus remains so far unclear, since neither a suitable animal model nor a permissive cell line to cultivate the virus are available. Elucidating the replication strategy of the human pathogenic sapovirus may contribute to a better understanding of its pathogenicity, being also an important pre-requisite for the development of new antiviral strategies against this relevant medical pathogen. In order to investigate the replication strategy of the human pathogenic sapovirus, a cDNA-clone encompassing the entire sapovirus genome was generated from a clinical sample. Based on phylogenetic analysis, the full-length genome of the sapovirus strain Hu/SaV/Dresden/pJG-SapI/2004/DE (GenBank accession number AY694184) was assigned to the Genogruppe I/ Genotype 1. For the investigation of the translation of the human pathogenic sapovirus in mammalian cells, polyclonal antibodies were generated against the nonstructural and structural sapovirus proteins. The sensitivity and specificity of the antibodies were validated using a transcription-translation driven cell free system. Translation of the sapovirus full-length-cDNA clone in the cell free system generated structural and nonstructural sapovirus proteins, in accordance with previously published reports. After translation, the sapovirus ORF1 polyprotein was processed in the nonstructural proteins NS1, NS2, NS3NTPase, NS4, NS5VPg, the fusion proteins NS1-3, NS2-3, NS4-5, NS4-7, NS5-7 and NS6-7Pro-Pol as well as the structural protein VP1. For the characterisation of the replication of the human pathogenic sapovirus in mammalian cells, different sapovirus cDNA-full length clones were generated. Upon transfection in 293-T cells, a translation of the sapovirus proteins was evidenced. However, this translation was not sapovirus-specific, as cDNA clones bearing a mutation in the active site of the sapovirus polymerase NS7Pol were also able to generate viral proteins. In order to further investigate the translation and replication of the sapovirus, the full length cDNA Genome was cloned into the pACYC-MCSII-Vector. Subsequently, a capped sapovirus full length RNA genome with a correct 5’-end and a 3’-end with a poly(A) tail was generated by in vitro transcription. Upon transfection in 293T-cells, the nonstructural fusion proteins NS2-3, NS4-5, NS4-7 and NS6-7Pro-Pol as well as the structural protein VP1 were translated. As a control, mutation of the active site of the nonstructural protein NS6Pro did not lead to processing of the viral enzymes, indicating that the processing of the ORF1-polyprotein in mammalian cells is strictly dependent on the activity of the sapovirus protease NS6Pro. Furthermore, replication of the sapovirus genomic RNA was investigated in mammalian cells. Upon transfection of the sapovirus full-length genomic RNA, replication of the sapovirus full-length RNA genomes was not evidenced in mammalian cells using quantitative real time RT-PCR. In order to exclude a possible flaw in the primary sequence of the viral genome hampering its replication, additional sapovirus full-length genomes were generated by direct amplification of the RNA from stool samples followed by in vitro transcription. Upon transfection in mammalian cells, the translation of sapovirus ORF1-polyprotein was evidenced in three clinical samples. However, replication of the viral genome did not occur. A similar observation was made when the total RNA from the clinical sample was used for transfection of mammalian cells, indicating that the lack of replication of the viral genome may be caused primarily by the cell line used, rather than the viral genome. In conclusion, the present work describes for the first time the successful processing of the ORF1-Polyprotein of the human pathogenic Sapovirus (strain Dresden pJG-SapI, GenBank accession number AY694184) in mammalian cells. This work may be a first step towards understanding the replication strategy of the human pathogenic and non-human pathogenic sapovirus (i.e. the porcine enteric calicivirus), being both important medical pathogens.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:DRESDEN/oai:qucosa:de:qucosa:10809 |
| Date | 23 June 2009 |
| Creators | Gebhardt, Julia |
| Contributors | Universität Leipzig |
| Source Sets | Hochschulschriftenserver (HSSS) der SLUB Dresden |
| Language | German |
| Detected Language | English |
| Type | doc-type:doctoralThesis, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis, doc-type:Text |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
| Relation | qucosa:11133 |
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