Septinas são GTPases capazes de se polimerizar. Essas proteínas, componentes do citoesqueleto, participam de diversos processos celulares nos quais elas se encontram associadas às membranas, como na citocinese, na ciliogênese e na exocitose. Para que possam exercer essas variadas funções, as septinas organizam-se como hetero-oligômeros (complexos) não-polares, os quais podem interagir entre si, formando estruturas maiores como filamentos, anéis e redes. Essas proteínas são altamente conservadas em eucariotos, todavia, o número de genes de septinas entre espécies é variável de uma, em Chlamydomonas reinhardtii, até mais de uma dezena de genes de septinas em humanos. Estudos anteriores do nosso grupo de pesquisa descreveram quatro septinas em Schistosoma mansoni, nomeadas SmSEPT5, SmSEPT10, SmSEPT7.1 e SmSEPT7.2. Ainda, recentemente, foi verificado que essas septinas são capazes de se ligar a membranas modelo, constituindo um modelo mais simples, quando comparadas às humanas, para estudar os mecanismos de associação às membranas. Neste trabalho, foram investigadas a influência da curvatura das membranas para a interação septinas-lipídios e a especificidade de septinas por diferentes fosfolipídios. Além das septinas de S. mansoni, o complexo de septinas de Ciona intestinalis foi também incluído, visando análises comparativas. Experimentos de microscopia confocal de fluorescência mostraram que tanto a SmSEPT10 isolada, quanto os complexos de septinas de S. mansoni e de C. intestinalis ligam-se, preferencialmente, a membranas com curvaturas de 2 μm-1(diâmetro de 0,96 μm). Essa tendência parece ser intrínseca de septinas, visto que complexos de outros organismos já haviam apresentado a mesma preferência. A capacidade de uma septina individual, no caso SmSEPT10, de distinguir curvaturas é um indicativo de que a polimerização não é necessária para esse mecanismo. A interação das septinas aos modelos de membrana só foi detectada na presença de dextrose, sugerindo que esse açúcar atue na estabilização dessas proteínas e abrindo novas frentes de estudo sobre a estabilidade das septinas. Os experimentos de microscopia, em conjunto com ensaios de PIP Strips, demonstraram que o complexo de septinas de C. intestinalis liga-se, preferencialmente, à fosfatidilserina, enquanto as septinas de S. mansoni apresentam uma preferência por fosfoinositóis. Finalmente, ensaios preliminares com construções mutantes do C-terminal da SmSEPT10 possibilitaram o desenvolvimento de uma hipótese para o mecanismo de associação dessa septina às membranas. / Septins are polymerizable GTPases. These cytoskeletal proteins are involved in several cellular processes in which they are associated to membranes, including cytokinesis, ciliogenesis and exocytosis. In order to perform these various functions, septins assemble into non-polar hetero-oligomers (complexes), which interact with each other forming higher-order structures such as filaments, ring and gauzes. These proteins are highly conserved in eukaryotes, yet the number of septin genes varies from one, in Chlamydomonas reinhardtii, to more than a dozen septin genes in humans. Previous studies from our research group described four septins in Schistosoma mansoni, named SmSEPT5, SmSEPT10, SmSEPT7.1 and SmSEPT7.2. Recently, it was verified that these proteins are capable of binding to model membranes, constituting a simpler model, when compared to human septins, to study the mechanism of membrane association. In this work, the influence of membrane curvature to the septin-lipid binding and the septin specificity to different phospholipids were investigated. In addition to S. mansoni septins, the septin complex from Ciona intestinalis was also included for comparative analyzes. Confocal fluorescence microscopy experiments showed that both SmSEPT10 and the septin complexes from S. mansoni and C. intestinalis bind, preferably, to membranes with 2 μm-1 curvatures (0,96 μm diameter). This tendency seems to be intrinsic to septins, as hetero-oligomers from other organisms had already presented the same binding preference. The capacity of an individual septin to distinguish curvatures is an indicative that the polymerization is not required for this mechanism. The interaction of these septins to the membrane models was only detected in the presence of dextrose, suggesting that this sugar acted in the protein stabilization, thus opening up new to study septin stability. These microscopy experiments, together with PIP Strips assays, demonstrated that the septin complex from C. intestinalis binds preferentially to phosphatidylserine, whereas septins from S. mansoni show a preference to phosphoinositides. Finally, preliminary assays with mutant constructions of SmSEPT10 C-terminal enabled the development of a hypothesis for the association mechanism of these proteins to membranes.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-02092019-101954 |
| Date | 28 May 2019 |
| Creators | Fontes, Marina Gabriel |
| Contributors | Araujo, Ana Paula Ulian de |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | Dissertação de Mestrado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
Page generated in 0.0043 seconds