O vigésimo primeiro aminoácido, selenocisteína (Sec), representa a principal forma biológica disponível de selênio, micronutriente essencial. A Sec possui vias de síntese distintas para bactérias, arqueobactérias e eucariotos, justificando estudos que avaliem sua particular consequência evolutiva. Naegleria gruberi, alvo do presente estudo, é um organismo modelo bastante interessante para compreensão das vias de síntese e incorporação do aminoácido em um dos três domínios da vida, por tratar-se de um eucarioto basal. A presença da via de biossíntese e incorporação de selenocisteína em N. gruberi foi descrita. Dentre os genes identificados, destaca-se uma Selenofosfato Sintetase ou SPS. A SPS possui um papel central na via de biossíntese de Sec, estando envolvida na catálise da conversão de seleneto e adenosina 5´-trifosfato (ATP) em selenofosfato, forma orgânica de selênio. A SPS de N. gruberi apresenta dois domínios distintos: o domínio C-terminal, que possui identidade com SPSs de bactérias (SelD) e o domínio N-terminal, similar a metiltransferases de eucariotos. Além disso, foi identificado no protozoário um análogo ao gene SelC de procariotos, responsável pela expressão de tRNASec. SelC promove a inserção da selenocisteína em selenoproteínas no códon UGA, que na maioria das vezes é interpretado como códon de parada de tradução em mRNAs. Além deste, dados experimentais apontam para a existência de outro tRNA traduzindo o códon UGA, sugerindo duas possíveis hipóteses: trata-se de um tRNASec adicional para incorporação de Sec, ou de um tRNA carreador de outro aminoácido, com a capacidade de reconhecer o mesmo códon. Este estudo realizou a expressão e purificação do domínio N-terminal da proteína SPS de Naegleria gruberi e procurou realizar estudos imunoquímicos com a proteína a partir da produção de anticorpos policlonais. Além disso, foram realizados o isolamento e purificação das duas diferentes isoformas de tRNASec identificadas no organismo a partir de ferramentas de bioinformática. Por último, foi dado início à uma investigação para determinar genes de referência para a realização de experimentos de qPCR em N. gruberi. Estes resultados contribuem para o entendimento da via de biossíntese de Sec em eucariotos e sua importância para o metabolismo celular. / The twenty-first amino acid, selenocysteine (Sec), represents the main biologically available form of selenium, an essential micronutrient, and shows different synthesis pathways for bacteria, archeobacteria and eukaryotes, justifying new studies to evaluate its particular evolutionary consequence. Naegleria gruberi is an extremely interesting model organism for the comprehension of the amino acid´s synthesis and incorporation pathways in one of the three domains of life, due to its position in the evolutionary scale as a basal eukaryote. The presence of the selenocysteine´s biosynthesis and insertion pathways in N. gruberi has been described. Amongst the identified genes, a Selenophosphate Synthetase or SPS has a central role. SPS acts on the biosynthesis of Sec, catalyzing the conversion of selenide and adenosine 5´-triphosphate (ATP) into selenophosphate, an organic form of selenium. N. gruberi´s SPS shows two distinct domains: a C-terminal domain having identity with bacterial SPSs (SelD) and a N-terminal domain, similar to eukaryotic methyltransferases. Besides that, an analogous to the SelC gene of prokaryotes was identified in the protozoan. SelC promotes the insertion of selenocysteine in selenoproteins on the UGA codon, a codon which is most of the time interpreted as a stop codon in mRNAs. Experimental data show evidence for the existence of yet another tRNA translating the UGA codon, suggesting two possible hypotheses: this tRNA is either the carrier of another amino acid with the capacity of recognizing the same codon, or an additional tRNA for Sec incorporation with different characteristics. The experiments performed for this study were able to heterologously express and purify the N-terminal domain of Naegleria gruberi´s SPS and pursued to characterize the protein through immunoassays using polyclonal antibodies. More experiments were run to isolate and purify the two different isoforms of tRNA identified in the organism using bioinformatics tools. Finally, an investigation was started aiming at determining reference genes for qPCR experiments with N. gruberi. These results contribute to a better understanding of the Sec´s biosynthesis and insertion pathways in eukaryotes and their importance for the cellular metabolism.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:teses.usp.br:tde-25052018-084426 |
| Date | 01 February 2018 |
| Creators | Thomás Michelena Santos |
| Contributors | Otavio Henrique Thiemann, Fernanda de Freitas Anibal, Regina Maria Barretto Cicarelli |
| Publisher | Universidade de São Paulo, Física, USP, BR |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Source | reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP, instname:Universidade de São Paulo, instacron:USP |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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