Em Escherichia coli a formação e incorporação do aminoácido selenocisteína é um evento cotraducional dirigido pelo códon de terminação UGA e deve se a uma complexa via de biosíntese cujas principais proteínas envolvidas são: Selenocisteína sintase (SELA), Fator de elongação de selenocisteína (SELB), Selenofosfato sintetase (SELD), Seril-tRNAser sintetase, um tRNA de inserção de selenocisteína (tRNAsec ou SELC) e uma sequência específica no RNA mensageiro, denominada de Sequência de inserção de selenocisteína (SECIS). A incorporação de selenocisteína em proteínas bacterianas inicia-se com a aminoacilação do tRNAsec com serina pela enzima Seril-tRNA sintetase formando seril-tRNAsec que é posteriormente convertido a selenocisteil-tRNAsec pela enzima SELA através de selenofosfato. Dessa forma, o trabalho teve seu foco estabelecido na realização de estudos bioquímicos e biofísicos da proteína SELA e na análise da interação dessa proteína com o ligante SELC para determinação de parâmetros de ligação envolvidos na formação desse complexo. O gene codificante para a proteína SELA foi subclonado, expresso em linhagem bacteriana WL81460(DE3) e a proteína SELA foi purificada como descrito na literatura; entretanto, uma nova metodologia para sua purificação foi desenvolvida proporcionando maior rapidez e rendimento. Estudos de filtração em gel, eletroforese nativa, focalização isoelétrica, dicroísmo circular, espectroscopia de fluorescência intrínseca e crosslinking químico proporcionaram uma melhor caracterização da proteína SELA e consequentemente uma maior compreensão de seu comportamento em solução. Ensaios de espectroscopia de anisotropia de fluorescência revelaram que a proteína SELA é capaz de se associar em estruturas superiores ao estado decamérico; essa análise pôde ser corroborada principalmente por dados de microscopia eletrônica empregando a técnica de negative staining. A metodologia de anisotropia de fluorescência também permitiu analisar a interação da macromolécula SELA com o ligante específico SELC, bem como com outros tRNAs mutantes possibilitando a realização de um mapeamento das regiões de SELC importantes para a interação. Além disso, essa técnica também foi satisfatoriamente empregada na determinação da estequiometria de ligação do complexo SELA-SELC revelando a proporção de 1 molécula de SELA para 10 tRNAs, o que contraria dados literários publicados em 1991 e 1992. / The formation and incorporation of the amino acid selenocysteine in Escherichia coli is an event directed by cotraducional UGA codon and involves a complex biosynthesis pathway whose main proteins are: Selenocysteine synthase (SELA), elongation factor of selenocysteine (SELB), Selenophosphate synthetase (SELD), Seryl-tRNA synthetase, a selenocysteine tRNA (tRNAsec or SELC) and a specific sequence on the messenger RNA, called Selenocysteine insertion sequence (SECIS). The incorporation of selenocysteine in proteins of bacteria begins with the tRNAsec aminoacylation with serine by the enzyme Seryl-tRNA synthetase resulting in seryl-tRNAsec which is subsequently converted to selenocysteyl-tRNAsec by the enzyme Selenocysteine synthase (SELA). The selenium used in the conversion reaction is provided by Selenophosphate synthetase as selenophosphate and finally, the selenocysteyl-tRNAsec is delivered by the factor SELB to the ribosome. The present study focused on biochemical and biophysical studies of SELA protein and analysis of its interaction with the specific ligand (SELC) for determination of binding parameters involved in the formation of the complex. The gene coding for SELA protein was subcloned, expressed in WL81460(DE3) bacterial strain and the protein was purified as described in the literature; however a new, faster and more efficient method for its purification was developed. Studies of gel filtration, native gel electrophoresis, isoelectric focusing, circular dichroism, intrinsic fluorescence spectroscopy and chemical crosslinking provided a better characterization of SELA protein and a greater understanding of its behavior in solution. Analysis of fluorescence anisotropy spectroscopy revealed that SELA was able to associate in a supramolecular state. This analysis was mainly corroborated by data from electron microscopy employing negative staining technique. Fluorescence anisotropy methodology allowed us to analyse the interaction of SELA protein with the specific ligand SELC, as well as with others mutated tRNAs enabling a mapping of important regions in SELC for interaction. In addition, fluorescence anisotropy technique was also successfully used in determining the stoichiometry ratio of the complex SELA-SELC, showing a proportion of 1 molecule of SELA to 10 tRNAs, contraring to the literary data published in 1991 and 1992.

O vigésimo primeiro aminoácido, selenocisteína (Sec), representa a principal forma biológica disponível de selênio, micronutriente essencial. A Sec possui vias de síntese distintas para bactérias, arqueobactérias e eucariotos, justificando estudos que avaliem sua particular consequência evolutiva. Naegleria gruberi, alvo do presente estudo, é um organismo modelo bastante interessante para compreensão das vias de síntese e incorporação do aminoácido em um dos três domínios da vida, por tratar-se de um eucarioto basal. A presença da via de biossíntese e incorporação de selenocisteína em N. gruberi foi descrita. Dentre os genes identificados, destaca-se uma Selenofosfato Sintetase ou SPS. A SPS possui um papel central na via de biossíntese de Sec, estando envolvida na catálise da conversão de seleneto e adenosina 5´-trifosfato (ATP) em selenofosfato, forma orgânica de selênio. A SPS de N. gruberi apresenta dois domínios distintos: o domínio C-terminal, que possui identidade com SPSs de bactérias (SelD) e o domínio N-terminal, similar a metiltransferases de eucariotos. Além disso, foi identificado no protozoário um análogo ao gene SelC de procariotos, responsável pela expressão de tRNASec. SelC promove a inserção da selenocisteína em selenoproteínas no códon UGA, que na maioria das vezes é interpretado como códon de parada de tradução em mRNAs. Além deste, dados experimentais apontam para a existência de outro tRNA traduzindo o códon UGA, sugerindo duas possíveis hipóteses: trata-se de um tRNASec adicional para incorporação de Sec, ou de um tRNA carreador de outro aminoácido, com a capacidade de reconhecer o mesmo códon. Este estudo realizou a expressão e purificação do domínio N-terminal da proteína SPS de Naegleria gruberi e procurou realizar estudos imunoquímicos com a proteína a partir da produção de anticorpos policlonais. Além disso, foram realizados o isolamento e purificação das duas diferentes isoformas de tRNASec identificadas no organismo a partir de ferramentas de bioinformática. Por último, foi dado início à uma investigação para determinar genes de referência para a realização de experimentos de qPCR em N. gruberi. Estes resultados contribuem para o entendimento da via de biossíntese de Sec em eucariotos e sua importância para o metabolismo celular. / The twenty-first amino acid, selenocysteine (Sec), represents the main biologically available form of selenium, an essential micronutrient, and shows different synthesis pathways for bacteria, archeobacteria and eukaryotes, justifying new studies to evaluate its particular evolutionary consequence. Naegleria gruberi is an extremely interesting model organism for the comprehension of the amino acid´s synthesis and incorporation pathways in one of the three domains of life, due to its position in the evolutionary scale as a basal eukaryote. The presence of the selenocysteine´s biosynthesis and insertion pathways in N. gruberi has been described. Amongst the identified genes, a Selenophosphate Synthetase or SPS has a central role. SPS acts on the biosynthesis of Sec, catalyzing the conversion of selenide and adenosine 5´-triphosphate (ATP) into selenophosphate, an organic form of selenium. N. gruberi´s SPS shows two distinct domains: a C-terminal domain having identity with bacterial SPSs (SelD) and a N-terminal domain, similar to eukaryotic methyltransferases. Besides that, an analogous to the SelC gene of prokaryotes was identified in the protozoan. SelC promotes the insertion of selenocysteine in selenoproteins on the UGA codon, a codon which is most of the time interpreted as a stop codon in mRNAs. Experimental data show evidence for the existence of yet another tRNA translating the UGA codon, suggesting two possible hypotheses: this tRNA is either the carrier of another amino acid with the capacity of recognizing the same codon, or an additional tRNA for Sec incorporation with different characteristics. The experiments performed for this study were able to heterologously express and purify the N-terminal domain of Naegleria gruberi´s SPS and pursued to characterize the protein through immunoassays using polyclonal antibodies. More experiments were run to isolate and purify the two different isoforms of tRNA identified in the organism using bioinformatics tools. Finally, an investigation was started aiming at determining reference genes for qPCR experiments with N. gruberi. These results contribute to a better understanding of the Sec´s biosynthesis and insertion pathways in eukaryotes and their importance for the cellular metabolism.

Em Escherichia coli a formação e incorporação do aminoácido selenocisteína é um evento cotraducional dirigido pelo códon de terminação UGA e deve se a uma complexa via de biosíntese cujas principais proteínas envolvidas são: Selenocisteína sintase (SELA), Fator de elongação de selenocisteína (SELB), Selenofosfato sintetase (SELD), Seril-tRNAser sintetase, um tRNA de inserção de selenocisteína (tRNAsec ou SELC) e uma sequência específica no RNA mensageiro, denominada de Sequência de inserção de selenocisteína (SECIS). A incorporação de selenocisteína em proteínas bacterianas inicia-se com a aminoacilação do tRNAsec com serina pela enzima Seril-tRNA sintetase formando seril-tRNAsec que é posteriormente convertido a selenocisteil-tRNAsec pela enzima SELA através de selenofosfato. Dessa forma, o trabalho teve seu foco estabelecido na realização de estudos bioquímicos e biofísicos da proteína SELA e na análise da interação dessa proteína com o ligante SELC para determinação de parâmetros de ligação envolvidos na formação desse complexo. O gene codificante para a proteína SELA foi subclonado, expresso em linhagem bacteriana WL81460(DE3) e a proteína SELA foi purificada como descrito na literatura; entretanto, uma nova metodologia para sua purificação foi desenvolvida proporcionando maior rapidez e rendimento. Estudos de filtração em gel, eletroforese nativa, focalização isoelétrica, dicroísmo circular, espectroscopia de fluorescência intrínseca e crosslinking químico proporcionaram uma melhor caracterização da proteína SELA e consequentemente uma maior compreensão de seu comportamento em solução. Ensaios de espectroscopia de anisotropia de fluorescência revelaram que a proteína SELA é capaz de se associar em estruturas superiores ao estado decamérico; essa análise pôde ser corroborada principalmente por dados de microscopia eletrônica empregando a técnica de negative staining. A metodologia de anisotropia de fluorescência também permitiu analisar a interação da macromolécula SELA com o ligante específico SELC, bem como com outros tRNAs mutantes possibilitando a realização de um mapeamento das regiões de SELC importantes para a interação. Além disso, essa técnica também foi satisfatoriamente empregada na determinação da estequiometria de ligação do complexo SELA-SELC revelando a proporção de 1 molécula de SELA para 10 tRNAs, o que contraria dados literários publicados em 1991 e 1992. / The formation and incorporation of the amino acid selenocysteine in Escherichia coli is an event directed by cotraducional UGA codon and involves a complex biosynthesis pathway whose main proteins are: Selenocysteine synthase (SELA), elongation factor of selenocysteine (SELB), Selenophosphate synthetase (SELD), Seryl-tRNA synthetase, a selenocysteine tRNA (tRNAsec or SELC) and a specific sequence on the messenger RNA, called Selenocysteine insertion sequence (SECIS). The incorporation of selenocysteine in proteins of bacteria begins with the tRNAsec aminoacylation with serine by the enzyme Seryl-tRNA synthetase resulting in seryl-tRNAsec which is subsequently converted to selenocysteyl-tRNAsec by the enzyme Selenocysteine synthase (SELA). The selenium used in the conversion reaction is provided by Selenophosphate synthetase as selenophosphate and finally, the selenocysteyl-tRNAsec is delivered by the factor SELB to the ribosome. The present study focused on biochemical and biophysical studies of SELA protein and analysis of its interaction with the specific ligand (SELC) for determination of binding parameters involved in the formation of the complex. The gene coding for SELA protein was subcloned, expressed in WL81460(DE3) bacterial strain and the protein was purified as described in the literature; however a new, faster and more efficient method for its purification was developed. Studies of gel filtration, native gel electrophoresis, isoelectric focusing, circular dichroism, intrinsic fluorescence spectroscopy and chemical crosslinking provided a better characterization of SELA protein and a greater understanding of its behavior in solution. Analysis of fluorescence anisotropy spectroscopy revealed that SELA was able to associate in a supramolecular state. This analysis was mainly corroborated by data from electron microscopy employing negative staining technique. Fluorescence anisotropy methodology allowed us to analyse the interaction of SELA protein with the specific ligand SELC, as well as with others mutated tRNAs enabling a mapping of important regions in SELC for interaction. In addition, fluorescence anisotropy technique was also successfully used in determining the stoichiometry ratio of the complex SELA-SELC, showing a proportion of 1 molecule of SELA to 10 tRNAs, contraring to the literary data published in 1991 and 1992.

O vigésimo primeiro aminoácido, selenocisteína (Sec), representa a principal forma biológica disponível de selênio, micronutriente essencial. A Sec possui vias de síntese distintas para bactérias, arqueobactérias e eucariotos, justificando estudos que avaliem sua particular consequência evolutiva. Naegleria gruberi, alvo do presente estudo, é um organismo modelo bastante interessante para compreensão das vias de síntese e incorporação do aminoácido em um dos três domínios da vida, por tratar-se de um eucarioto basal. A presença da via de biossíntese e incorporação de selenocisteína em N. gruberi foi descrita. Dentre os genes identificados, destaca-se uma Selenofosfato Sintetase ou SPS. A SPS possui um papel central na via de biossíntese de Sec, estando envolvida na catálise da conversão de seleneto e adenosina 5´-trifosfato (ATP) em selenofosfato, forma orgânica de selênio. A SPS de N. gruberi apresenta dois domínios distintos: o domínio C-terminal, que possui identidade com SPSs de bactérias (SelD) e o domínio N-terminal, similar a metiltransferases de eucariotos. Além disso, foi identificado no protozoário um análogo ao gene SelC de procariotos, responsável pela expressão de tRNASec. SelC promove a inserção da selenocisteína em selenoproteínas no códon UGA, que na maioria das vezes é interpretado como códon de parada de tradução em mRNAs. Além deste, dados experimentais apontam para a existência de outro tRNA traduzindo o códon UGA, sugerindo duas possíveis hipóteses: trata-se de um tRNASec adicional para incorporação de Sec, ou de um tRNA carreador de outro aminoácido, com a capacidade de reconhecer o mesmo códon. Este estudo realizou a expressão e purificação do domínio N-terminal da proteína SPS de Naegleria gruberi e procurou realizar estudos imunoquímicos com a proteína a partir da produção de anticorpos policlonais. Além disso, foram realizados o isolamento e purificação das duas diferentes isoformas de tRNASec identificadas no organismo a partir de ferramentas de bioinformática. Por último, foi dado início à uma investigação para determinar genes de referência para a realização de experimentos de qPCR em N. gruberi. Estes resultados contribuem para o entendimento da via de biossíntese de Sec em eucariotos e sua importância para o metabolismo celular. / The twenty-first amino acid, selenocysteine (Sec), represents the main biologically available form of selenium, an essential micronutrient, and shows different synthesis pathways for bacteria, archeobacteria and eukaryotes, justifying new studies to evaluate its particular evolutionary consequence. Naegleria gruberi is an extremely interesting model organism for the comprehension of the amino acid´s synthesis and incorporation pathways in one of the three domains of life, due to its position in the evolutionary scale as a basal eukaryote. The presence of the selenocysteine´s biosynthesis and insertion pathways in N. gruberi has been described. Amongst the identified genes, a Selenophosphate Synthetase or SPS has a central role. SPS acts on the biosynthesis of Sec, catalyzing the conversion of selenide and adenosine 5´-triphosphate (ATP) into selenophosphate, an organic form of selenium. N. gruberi´s SPS shows two distinct domains: a C-terminal domain having identity with bacterial SPSs (SelD) and a N-terminal domain, similar to eukaryotic methyltransferases. Besides that, an analogous to the SelC gene of prokaryotes was identified in the protozoan. SelC promotes the insertion of selenocysteine in selenoproteins on the UGA codon, a codon which is most of the time interpreted as a stop codon in mRNAs. Experimental data show evidence for the existence of yet another tRNA translating the UGA codon, suggesting two possible hypotheses: this tRNA is either the carrier of another amino acid with the capacity of recognizing the same codon, or an additional tRNA for Sec incorporation with different characteristics. The experiments performed for this study were able to heterologously express and purify the N-terminal domain of Naegleria gruberi´s SPS and pursued to characterize the protein through immunoassays using polyclonal antibodies. More experiments were run to isolate and purify the two different isoforms of tRNA identified in the organism using bioinformatics tools. Finally, an investigation was started aiming at determining reference genes for qPCR experiments with N. gruberi. These results contribute to a better understanding of the Sec´s biosynthesis and insertion pathways in eukaryotes and their importance for the cellular metabolism.

A biossíntese do 21o. aminoácido, Selenocisteína (Sec - U), envolve uma complexa maquinaria enzimática composta, em eubactérias, pela Selenocisteína Sintase (SELA), Fator de Elongação de Selenocisteína (SELB), Selenofosfato Sintetase (SELD) e tRNA de Inserção Selenocisteína (tRNAsec). Em arqueobactérias e eucariotos existem ainda O fosforil tRNAsec Kinase (PSTK), SepSecS como SELA, EFSec como SELB, SPS1 e 2 como SELD e Proteína Ligante ao SECIS 2 (SBP2). O resíduo Selenocisteína é incorporado à proteína nascente no códon semelhante ao UGA de terminação identificado como local para incorporação de Sec, pela presença da Sequência de Inserção de Selenocisteína (SECIS), juntamente ao códon UGA na região codificante em bactérias e na região 3\'não codificante em arqueobactérias e eucariotos. SELA desempenha um papel central nessa via de biossíntese pela modificação do resíduo de Serina carregado ao tRNAsec pela enzima Seril-tRNA Sintetase (SerRS) convertendo-o em Selenocisteína. Essa enzima forma um complexo homodecamérico que reconhece e liga-se especificamente a SeriltRNAsec. A interação específica entre SELA e o tRNA permanece ainda não determinada. Nosso objetivo é a investigação estrutural por Espalhamento de Raios-X a Baixos Ângulos (SAXS) e cristalização da SELA e SELA-tRNAsec de Escherichia coli. Dados de SAXS determinaram parâmetros dimensionais como dimensão máxima, massa molecular e raio de giro. O modelo ab-inition foi calculado assumindo a simetria P52 de projeções de Microscopia Eletrônica de Transmissão (TEM). Os cristais obtidos do complexo SELA-tRNA mostraram o grupo espacial e dimensões da cela, apesar da baixa resolução dos dados. Para melhorar os estudos estruturais um modelo para proteína SELA de Escherichia coli foi construído usando o alinhamento da sequência de aminoácidos e o PDB, da proteína SELA putativa, de Methanococcus jannaschii, que apesar da baixa identidade resultou em um modelo muito bom. Adicionalmente, uma Análise de Acoplamento Estatístico (SCA) foi realizada baseada em alinhamentos múltiplos da proteína SELA, ordenando os aminoácidos mais conservados e a relação existente entre eles. / The biosynthesis of the 21th amino acid, Selenocysteine (Sec - U), requires complex enzymatic machinery composed in eubacteria of: Selenocysteine Synthase (SELA), Selenocysteine Specific Elongation Factor (SELB), Selenophosphate Synthetase (SELD) and a specific Selenocysteine Inserting tRNA (tRNAsec). In archaeabacteria and eukaryotes there are O phosphoryl tRNAsec Kinase (PSTK), SepSecS as SELA, EFSec as SELB, SPS1 and 2 as SELD and SECIS Binding Protein 2 (SBP2). The Selenocysteine residue is incorporated into a nascent protein at a UGA like stop codon signaling as a Sec incorporation site by the presence of a Selenocysteine Insertion Sequence (SECIS), embedding the UGA codon in the coding region in bacteria and in a 3\' UTR in archaea and eukarya. SELA plays a central role in this pathway by modifying the Serine residue charged into the tRNAsec by Seryl-tRNA Synthetase (SerRS) and converting it into Selenocysteine. This enzyme forms a homodecameric complex that specifically recognizes and binds to Seryl-tRNAsec. The specific interaction of SELA and its tRNA remains unclear. Our aim is the structural investigation by Small Angle X ray Scattering (SAXS) and crystallization of Escherichia coli SELA and SELA-tRNAsec. SAXS datas determined dimensional parameters as maximum dimension, molecular mass and radius of gyration. Abinition model calculation was made assuming a P52 symmetry from Transmission Electron Microscope (TEM) projections Crystals of SELA-tRNA complex shown the space-group and cell dimensions, although its low resolution. To improve the structural studies a SELA model of E. coli was built using the amino acid sequences alignment and the PDB from Methanococcus jannaschii, SELA putative protein, which although the lower identities result in a very good model. In addition, a Statistical Coupling Analysis (SCA) was performed based on a multiple sequence alignment of SELA, ordering the most preserved amino acid and the relation between them.

A síntese de selenocisteína e sua incorporação co-traducional em selenoproteínas como resposta a um códon UGA em fase requerem uma complexa maquinaria molecular. Em eucariotos, foram identificados componentes que participam da reação de formação de selenocisteína: Seril-tRNA sintetase (SerRS), O-fosfoseril-tRNA quinase (PSTK), SECIS Binding Protein 2 SBP2, um fator de elongação específico para Sec (EFSec), selenofosfato sintetase 1 (SPS1) e selenofosfato sintetase 2 (SPS2), SEPSECS, proteína ligante de RNA SECp43, proteína ribossomal L30, um tRNA de inserção de selenocisteína (tRNASec, SELC) e uma sequência específica no RNA mensageiro (elemento SECIS). O primeiro passo da incorporação de selenocisteína em proteínas é realizado pela SerRS, que aminoacila o tRNA com serina através da ativação da serina por Mg+2 e ATP, levando a formação de um intermediário ligado a enzima (Ser-AMP). Posteriormente, ocorre a mudança do radical Ser do intermediário Ser-AMP para o tRNASec, e subsequentemente, a conversão enzimática de Ser-tRNASec para Sec-tRNASec. Através de análises in sílico nosso grupo identificou componentes da maquinaria de inserção de selenocisteína em espécies de Kinetoplastida. Foram identificados homólogos de tRNASec e as enzimas TbSerRS, TbSPS2, TbPSTK, TbSepSecS e TbEFSec. Nosso principal alvo é o estudo estrutural da SerRS de Trypanosoma brucei nativa e em complexo com o tRNASec e com as isoformas do tRNASer. Uma nova metodologia no processo de purificação desta enzima foi desenvolvida e, através das técnicas de cromatografia de exclusão molecular, espalhamento de luz dinâmico e ultracentrifugação analítica conseguimos determinar o estado oligomérico da TbSerRS. O resultado de dímeros em solução corroborou com dados reportados na literatura, além de verificarmos por meio de estudos de cinética enzimática que a enzima encontra-se ativa sob as condições utilizadas. A técnica de ultracentrifugação analítica de sedimentação em equilíbrio também nos permitiu verificar a formação do complexo SerRS-tRNA, mas não nos possibilitou definir a estequiometria deste complexo. Estudos estruturais da enzima nativa e em interação com os tRNAs SELC e com as isoformas do tRNASer, L-serina, um análogo não hidrolisável de AMP, MgCl2, e com porções menores dos tRNAs foram realizados por meio da cristalografia por difração de raios X. Através dessa técnica, dezessete conjunto de dados foram coletados, processados e estão em fase de refinamento. Algumas análises estruturais possibilitaram confirmar a presença de duas moléculas de glicerol em cada monômero na região do sítio ativo para a estrutura da TbSerRS nativa e uma molécula de dAMP para o complexo TbSerRS-dAMP. / The synthesis of selenocysteine and its co-translational incorporation in selenoproteins in response to a UGA codon in frame require complex molecular machinery. In eukaryotes, components that participate in the reaction of selenocysteine formation were identified: SeryltRNA synthetase (SerRS), O-phosphoseryl-tRNA kinase (PSTK), SECIS Binding Protein 2 - SBP2, a selenocysteine-specific elongation factor (EFSec), selenophosphate synthetase 1 (SPS1) and selenophosphate synthetase 2 (SPS2), SEPSECS, SECp43 RNA binding protein, ribosomal protein L30, selenocysteine tRNA (tRNASec, SELC), and a specific sequence in the messenger RNA (SECIS element). The first step for selenocysteine incorporating is performed by SerRS that aminoacylates the tRNA with serine through serine activation by Mg2+ and ATP leading to the formation of an intermediate linked to the enzyme (Ser-AMP). Subsequently, the change of the Ser radical to tRNASec takes place followed by the enzymatic conversion of Ser-tRNASec to Sec-tRNASec. Through in silico analysis our group has identified components of the selenocysteine insertion machinery in species of Kinetoplastida. Homologues of tRNASec and the enzymes TbSerRS, TbSPS2, TbPSTK, TbSepSecS and TbEFSec were identified. Our main target is the structural study of the native SerRS from Trypanosoma brucei and SerRS in complex with the tRNASec and the tRNASer isoforms. A new methodology in the purification process of this enzyme has been developed, and through molecular exclusion chromatography, dynamic light scattering and analytical ultracentrifugation techniques we were able to determine the oligomeric state of TbSerRS. The result of dimers in solution corroborated with the data reported in the literature. Moreover, we were able to verify through studies of enzyme kinetics that the enzyme is active. The sedimentation equilibrium analytical ultracentrifugation technique also demonstrated the formation of the SerRS-tRNA complex, however, it did not allow the definition of the complex stoichiometry. Structural studies of the native enzyme and its interaction with SELC, tRNASer isoforms, L-serine, a non-hydrolyzable AMP analog, MgCl2, and smaller portions of tRNAs were performed by X-ray diffraction crystallography. Through this technique, seventeen data sets were collected, processed, and are being submitted to refinement processes. Initial structural analysis allowed the confirmation of the presence of two glycerol molecules in each monomer in the active site region in the native structure of TbSerRS and one dAMP molecule in the TbSerRS-dAMP complex.

A biossíntese do 21o. aminoácido, Selenocisteína (Sec - U), envolve uma complexa maquinaria enzimática composta, em eubactérias, pela Selenocisteína Sintase (SELA), Fator de Elongação de Selenocisteína (SELB), Selenofosfato Sintetase (SELD) e tRNA de Inserção Selenocisteína (tRNAsec). Em arqueobactérias e eucariotos existem ainda O fosforil tRNAsec Kinase (PSTK), SepSecS como SELA, EFSec como SELB, SPS1 e 2 como SELD e Proteína Ligante ao SECIS 2 (SBP2). O resíduo Selenocisteína é incorporado à proteína nascente no códon semelhante ao UGA de terminação identificado como local para incorporação de Sec, pela presença da Sequência de Inserção de Selenocisteína (SECIS), juntamente ao códon UGA na região codificante em bactérias e na região 3\'não codificante em arqueobactérias e eucariotos. SELA desempenha um papel central nessa via de biossíntese pela modificação do resíduo de Serina carregado ao tRNAsec pela enzima Seril-tRNA Sintetase (SerRS) convertendo-o em Selenocisteína. Essa enzima forma um complexo homodecamérico que reconhece e liga-se especificamente a SeriltRNAsec. A interação específica entre SELA e o tRNA permanece ainda não determinada. Nosso objetivo é a investigação estrutural por Espalhamento de Raios-X a Baixos Ângulos (SAXS) e cristalização da SELA e SELA-tRNAsec de Escherichia coli. Dados de SAXS determinaram parâmetros dimensionais como dimensão máxima, massa molecular e raio de giro. O modelo ab-inition foi calculado assumindo a simetria P52 de projeções de Microscopia Eletrônica de Transmissão (TEM). Os cristais obtidos do complexo SELA-tRNA mostraram o grupo espacial e dimensões da cela, apesar da baixa resolução dos dados. Para melhorar os estudos estruturais um modelo para proteína SELA de Escherichia coli foi construído usando o alinhamento da sequência de aminoácidos e o PDB, da proteína SELA putativa, de Methanococcus jannaschii, que apesar da baixa identidade resultou em um modelo muito bom. Adicionalmente, uma Análise de Acoplamento Estatístico (SCA) foi realizada baseada em alinhamentos múltiplos da proteína SELA, ordenando os aminoácidos mais conservados e a relação existente entre eles. / The biosynthesis of the 21th amino acid, Selenocysteine (Sec - U), requires complex enzymatic machinery composed in eubacteria of: Selenocysteine Synthase (SELA), Selenocysteine Specific Elongation Factor (SELB), Selenophosphate Synthetase (SELD) and a specific Selenocysteine Inserting tRNA (tRNAsec). In archaeabacteria and eukaryotes there are O phosphoryl tRNAsec Kinase (PSTK), SepSecS as SELA, EFSec as SELB, SPS1 and 2 as SELD and SECIS Binding Protein 2 (SBP2). The Selenocysteine residue is incorporated into a nascent protein at a UGA like stop codon signaling as a Sec incorporation site by the presence of a Selenocysteine Insertion Sequence (SECIS), embedding the UGA codon in the coding region in bacteria and in a 3\' UTR in archaea and eukarya. SELA plays a central role in this pathway by modifying the Serine residue charged into the tRNAsec by Seryl-tRNA Synthetase (SerRS) and converting it into Selenocysteine. This enzyme forms a homodecameric complex that specifically recognizes and binds to Seryl-tRNAsec. The specific interaction of SELA and its tRNA remains unclear. Our aim is the structural investigation by Small Angle X ray Scattering (SAXS) and crystallization of Escherichia coli SELA and SELA-tRNAsec. SAXS datas determined dimensional parameters as maximum dimension, molecular mass and radius of gyration. Abinition model calculation was made assuming a P52 symmetry from Transmission Electron Microscope (TEM) projections Crystals of SELA-tRNA complex shown the space-group and cell dimensions, although its low resolution. To improve the structural studies a SELA model of E. coli was built using the amino acid sequences alignment and the PDB from Methanococcus jannaschii, SELA putative protein, which although the lower identities result in a very good model. In addition, a Statistical Coupling Analysis (SCA) was performed based on a multiple sequence alignment of SELA, ordering the most preserved amino acid and the relation between them.

A síntese de selenocisteína e sua incorporação co-traducional em selenoproteínas como resposta a um códon UGA em fase requerem uma complexa maquinaria molecular. Em eucariotos, foram identificados componentes que participam da reação de formação de selenocisteína: Seril-tRNA sintetase (SerRS), O-fosfoseril-tRNA quinase (PSTK), SECIS Binding Protein 2 SBP2, um fator de elongação específico para Sec (EFSec), selenofosfato sintetase 1 (SPS1) e selenofosfato sintetase 2 (SPS2), SEPSECS, proteína ligante de RNA SECp43, proteína ribossomal L30, um tRNA de inserção de selenocisteína (tRNASec, SELC) e uma sequência específica no RNA mensageiro (elemento SECIS). O primeiro passo da incorporação de selenocisteína em proteínas é realizado pela SerRS, que aminoacila o tRNA com serina através da ativação da serina por Mg+2 e ATP, levando a formação de um intermediário ligado a enzima (Ser-AMP). Posteriormente, ocorre a mudança do radical Ser do intermediário Ser-AMP para o tRNASec, e subsequentemente, a conversão enzimática de Ser-tRNASec para Sec-tRNASec. Através de análises in sílico nosso grupo identificou componentes da maquinaria de inserção de selenocisteína em espécies de Kinetoplastida. Foram identificados homólogos de tRNASec e as enzimas TbSerRS, TbSPS2, TbPSTK, TbSepSecS e TbEFSec. Nosso principal alvo é o estudo estrutural da SerRS de Trypanosoma brucei nativa e em complexo com o tRNASec e com as isoformas do tRNASer. Uma nova metodologia no processo de purificação desta enzima foi desenvolvida e, através das técnicas de cromatografia de exclusão molecular, espalhamento de luz dinâmico e ultracentrifugação analítica conseguimos determinar o estado oligomérico da TbSerRS. O resultado de dímeros em solução corroborou com dados reportados na literatura, além de verificarmos por meio de estudos de cinética enzimática que a enzima encontra-se ativa sob as condições utilizadas. A técnica de ultracentrifugação analítica de sedimentação em equilíbrio também nos permitiu verificar a formação do complexo SerRS-tRNA, mas não nos possibilitou definir a estequiometria deste complexo. Estudos estruturais da enzima nativa e em interação com os tRNAs SELC e com as isoformas do tRNASer, L-serina, um análogo não hidrolisável de AMP, MgCl2, e com porções menores dos tRNAs foram realizados por meio da cristalografia por difração de raios X. Através dessa técnica, dezessete conjunto de dados foram coletados, processados e estão em fase de refinamento. Algumas análises estruturais possibilitaram confirmar a presença de duas moléculas de glicerol em cada monômero na região do sítio ativo para a estrutura da TbSerRS nativa e uma molécula de dAMP para o complexo TbSerRS-dAMP. / The synthesis of selenocysteine and its co-translational incorporation in selenoproteins in response to a UGA codon in frame require complex molecular machinery. In eukaryotes, components that participate in the reaction of selenocysteine formation were identified: SeryltRNA synthetase (SerRS), O-phosphoseryl-tRNA kinase (PSTK), SECIS Binding Protein 2 - SBP2, a selenocysteine-specific elongation factor (EFSec), selenophosphate synthetase 1 (SPS1) and selenophosphate synthetase 2 (SPS2), SEPSECS, SECp43 RNA binding protein, ribosomal protein L30, selenocysteine tRNA (tRNASec, SELC), and a specific sequence in the messenger RNA (SECIS element). The first step for selenocysteine incorporating is performed by SerRS that aminoacylates the tRNA with serine through serine activation by Mg2+ and ATP leading to the formation of an intermediate linked to the enzyme (Ser-AMP). Subsequently, the change of the Ser radical to tRNASec takes place followed by the enzymatic conversion of Ser-tRNASec to Sec-tRNASec. Through in silico analysis our group has identified components of the selenocysteine insertion machinery in species of Kinetoplastida. Homologues of tRNASec and the enzymes TbSerRS, TbSPS2, TbPSTK, TbSepSecS and TbEFSec were identified. Our main target is the structural study of the native SerRS from Trypanosoma brucei and SerRS in complex with the tRNASec and the tRNASer isoforms. A new methodology in the purification process of this enzyme has been developed, and through molecular exclusion chromatography, dynamic light scattering and analytical ultracentrifugation techniques we were able to determine the oligomeric state of TbSerRS. The result of dimers in solution corroborated with the data reported in the literature. Moreover, we were able to verify through studies of enzyme kinetics that the enzyme is active. The sedimentation equilibrium analytical ultracentrifugation technique also demonstrated the formation of the SerRS-tRNA complex, however, it did not allow the definition of the complex stoichiometry. Structural studies of the native enzyme and its interaction with SELC, tRNASer isoforms, L-serine, a non-hydrolyzable AMP analog, MgCl2, and smaller portions of tRNAs were performed by X-ray diffraction crystallography. Through this technique, seventeen data sets were collected, processed, and are being submitted to refinement processes. Initial structural analysis allowed the confirmation of the presence of two glycerol molecules in each monomer in the active site region in the native structure of TbSerRS and one dAMP molecule in the TbSerRS-dAMP complex.

Selenoproteine enthalten die 21. Aminosäure Selenocystein (Sec), das über einen speziellen Mechanismus in Proteine eingebaut wird. Dieser beinhaltet eine Rekodierung des „Stopp“-Codons UGA in ein Sec-Codon unter Anleitung und Interaktion mehrerer Sec-spezifischer Faktoren, von denen einige sowie deren Funktionen bisher noch unbekannt sind. Darunter das SECp43, das als Kofaktor in der Selenoproteinbiosynthese vermutet wird. Aufgrund früherer Befunde wurde die Rolle von SECp43 in der Selenoproteinbiosynthese in vivo am Mausmodell untersucht und die Interaktion von SECp43 mit der tRNASec in vitro erneut getestet. Es wurden zwei Secp43-Mausmutanten generiert, wobei eine mit konstitutiv deletierten Exons 3 und 4, inklusive des ersten RNA recognition motif, keine Effekte zeigte. Die zweite Mutante hingegen, mit einer konstitutiven Deletion der Exons 7 und 8, welche die Tyrosin-reiche Region eliminierte, war embryonal letal. Eine dementsprechende leberspezifische Secp43-Inaktivierung wurde durchgeführt, um dort die Selenoproteinexpression zu analysieren. Die generierten Alb-Cre; Secp43fl/fl-Mäuse wiesen jedoch keine veränderte Expression auf. Weiterhin zeigten die Interaktionsstudien eine Bindung von SECp43 mit der tRNASec in vitro, die aber noch verifiziert werden muss. Die deletierten Domänen von SECp43 scheinen nicht essentiell für die Selenoproteinexpression in Hepatozyten zu sein. Darum wurde über eine konditionale Secp43-Inaktivierung in Neuronen überprüft, ob SECp43 in anderen Zellen essentiell ist. Bis auf einen leichten Bewegungsphänotyp wurde keine Veränderung der Selenoproteinexpression im Gehirn der Mutanten gefunden. Ein weiterer unbekannter Faktor ist die 2´O- Methyltransferase der tRNASec-Isoform mcm5Um. Die Präsenz der Isoform scheint mit der Expression stressbezogener Selenoproteine zu korrelieren. Anlässlich früherer Ergebnisse galt die RNMTL1 als ein Kandidat, deren Einfluss sowie der von Deletionsmutanten auf die Selenoproteinenexpression in HepG2-Zellen, insbesondere der Dejodase 1, getestet wurde, jedoch ohne einen Effekt zu zeigen und die früheren Ergebnisse zu reproduzieren. Auch konnte keine eindeutige Bindung von RNMTL1 mit der tRNASec in vitro im Interaktionstest nachgewiesen werden. Zudem wurde ein RNMTL1-Transport in die Mitochondrien angenommen, der vor allem über Importassays von unserer Kooperationsgruppe bestätigt wurde. Kurz nach Abschluss dieser Versuche wurde die RNMTL1 als die 2´O-Methyltransferase der Ribose von G1370 des 16S-rRNA-Kerns der humanen großen mitochondrialen Ribosomenuntereinheit identifiziert, wodurch unter Einbeziehung der Ergebnisse dieser Arbeit die RNMTL1 als Kandidat der 2´O- Methyltransferase der mcm5Um verworfen werden kann. / Selenoproteins contain the 21st amino acid selenocysteine (Sec). Sec is incorporated into proteins by a specific mechanism requiring the recoding of UGA stop codons into a SEC codon under guidance and interaction of several Sec-specific factors. Many of these are still unidentified and their functions unknown. SECp43 represents one of them which is hypothesized to serve as a co-factor in selenoprotein biosynthesis. Due to former results the role of SECp43 within the selenoprotein biosynthesis was analyzed in vivo in a mouse model and in addition the interaction between SECp43 and the tRNASec was tested again in vitro. Two Secp43 mouse mutants were generated whereupon one with constitutive deletion of exons 3 and 4, including the first RNA recognition motif, wasn’t showing any effect. In contrast the second mutant with a constitutive deletion of exons 7 and 8, including the tyrosine-rich region, was embryonal lethal. A corresponding liver specific inactivation of Secp43 was carried out to analyze the local selenoprotein expression. However, the generated Alb-Cre; Secp43fl/fl-mice didn’t exhibit any changes in the selenoprotein expression. Furthermore, the binding studies demonstrated an interaction of SECp43 with tRNASec in vitro, but which has to be verified specifically. The eliminated domains of SECp43 appear not to be essential for selenoprotein biosynthesis in hepatocytes. Thus, it was tested whether SECp43 is essential in other cells via a conditional inactivation of Secp43 in neurons. Other than a slight mobility phenotype there was no altered selenoprotein expression in the brain of mutant mice observed. The 2´O-methyltransferase of the tRNASec isoform mcm5Um stands for another unidentified factor. Due to prior investigation, RNMTL1 served as a potential candidate. The presence of this isoform is supposed to correlate with expression of stress-related selenoproteins. Thereby, the influence of RNMTL1 and whose corresponding deletion mutants on selenoprotein expression in HepG2 cells, particularly deiodinase 1, was tested. But no effect was shown and former findings couldn’t be reproduced. Additionally, no distinct interaction of RNMTL1 with the tRNASec through binding tests in vitro could be detected. Moreover, a transport of RNMTL1 into mitochondria was assumed, which was confirmed primarily via import assays by our cooperation partner. Briefly after finishing these experiments, the RNMTL1 was identified as the responsible 2´O-methyltransferase of the ribose at position G1370 of the 16S rRNA core from the large human mitochondrial ribosome subunit. Thus, in addition to our results, lead to the conclusion that RNMTL1 is not the responsible 2´O-methyltransferase of mcm5Um.

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