Selenoproteine enthalten die 21. Aminosäure Selenocystein (Sec), das über einen speziellen Mechanismus in Proteine eingebaut wird. Dieser beinhaltet eine Rekodierung des „Stopp“-Codons UGA in ein Sec-Codon unter Anleitung und Interaktion mehrerer Sec-spezifischer Faktoren, von denen einige sowie deren Funktionen bisher noch unbekannt sind. Darunter das SECp43, das als Kofaktor in der Selenoproteinbiosynthese vermutet wird. Aufgrund früherer Befunde wurde die Rolle von SECp43 in der Selenoproteinbiosynthese in vivo am Mausmodell untersucht und die Interaktion von SECp43 mit der tRNASec in vitro erneut getestet. Es wurden zwei Secp43-Mausmutanten generiert, wobei eine mit konstitutiv deletierten Exons 3 und 4, inklusive des ersten RNA recognition motif, keine Effekte zeigte. Die zweite Mutante hingegen, mit einer konstitutiven Deletion der Exons 7 und 8, welche die Tyrosin-reiche Region eliminierte, war embryonal letal. Eine dementsprechende leberspezifische Secp43-Inaktivierung wurde durchgeführt, um dort die Selenoproteinexpression zu analysieren. Die generierten Alb-Cre; Secp43fl/fl-Mäuse wiesen jedoch keine veränderte Expression auf. Weiterhin zeigten die Interaktionsstudien eine Bindung von SECp43 mit der tRNASec in vitro, die aber noch verifiziert werden muss. Die deletierten Domänen von SECp43 scheinen nicht essentiell für die Selenoproteinexpression in Hepatozyten zu sein. Darum wurde über eine konditionale Secp43-Inaktivierung in Neuronen überprüft, ob SECp43 in anderen Zellen essentiell ist. Bis auf einen leichten Bewegungsphänotyp wurde keine Veränderung der Selenoproteinexpression im Gehirn der Mutanten gefunden. Ein weiterer unbekannter Faktor ist die 2´O- Methyltransferase der tRNASec-Isoform mcm5Um. Die Präsenz der Isoform scheint mit der Expression stressbezogener Selenoproteine zu korrelieren. Anlässlich früherer Ergebnisse galt die RNMTL1 als ein Kandidat, deren Einfluss sowie der von Deletionsmutanten auf die Selenoproteinenexpression in HepG2-Zellen, insbesondere der Dejodase 1, getestet wurde, jedoch ohne einen Effekt zu zeigen und die früheren Ergebnisse zu reproduzieren. Auch konnte keine eindeutige Bindung von RNMTL1 mit der tRNASec in vitro im Interaktionstest nachgewiesen werden. Zudem wurde ein RNMTL1-Transport in die Mitochondrien angenommen, der vor allem über Importassays von unserer Kooperationsgruppe bestätigt wurde. Kurz nach Abschluss dieser Versuche wurde die RNMTL1 als die 2´O-Methyltransferase der Ribose von G1370 des 16S-rRNA-Kerns der humanen großen mitochondrialen Ribosomenuntereinheit identifiziert, wodurch unter Einbeziehung der Ergebnisse dieser Arbeit die RNMTL1 als Kandidat der 2´O- Methyltransferase der mcm5Um verworfen werden kann. / Selenoproteins contain the 21st amino acid selenocysteine (Sec). Sec is incorporated into proteins by a specific mechanism requiring the recoding of UGA stop codons into a SEC codon under guidance and interaction of several Sec-specific factors. Many of these are still unidentified and their functions unknown. SECp43 represents one of them which is hypothesized to serve as a co-factor in selenoprotein biosynthesis. Due to former results the role of SECp43 within the selenoprotein biosynthesis was analyzed in vivo in a mouse model and in addition the interaction between SECp43 and the tRNASec was tested again in vitro. Two Secp43 mouse mutants were generated whereupon one with constitutive deletion of exons 3 and 4, including the first RNA recognition motif, wasn’t showing any effect. In contrast the second mutant with a constitutive deletion of exons 7 and 8, including the tyrosine-rich region, was embryonal lethal. A corresponding liver specific inactivation of Secp43 was carried out to analyze the local selenoprotein expression. However, the generated Alb-Cre; Secp43fl/fl-mice didn’t exhibit any changes in the selenoprotein expression. Furthermore, the binding studies demonstrated an interaction of SECp43 with tRNASec in vitro, but which has to be verified specifically. The eliminated domains of SECp43 appear not to be essential for selenoprotein biosynthesis in hepatocytes. Thus, it was tested whether SECp43 is essential in other cells via a conditional inactivation of Secp43 in neurons. Other than a slight mobility phenotype there was no altered selenoprotein expression in the brain of mutant mice observed. The 2´O-methyltransferase of the tRNASec isoform mcm5Um stands for another unidentified factor. Due to prior investigation, RNMTL1 served as a potential candidate. The presence of this isoform is supposed to correlate with expression of stress-related selenoproteins. Thereby, the influence of RNMTL1 and whose corresponding deletion mutants on selenoprotein expression in HepG2 cells, particularly deiodinase 1, was tested. But no effect was shown and former findings couldn’t be reproduced. Additionally, no distinct interaction of RNMTL1 with the tRNASec through binding tests in vitro could be detected. Moreover, a transport of RNMTL1 into mitochondria was assumed, which was confirmed primarily via import assays by our cooperation partner. Briefly after finishing these experiments, the RNMTL1 was identified as the responsible 2´O-methyltransferase of the ribose at position G1370 of the 16S rRNA core from the large human mitochondrial ribosome subunit. Thus, in addition to our results, lead to the conclusion that RNMTL1 is not the responsible 2´O-methyltransferase of mcm5Um.

Selenoproteins are proteins containing selenium in the form of the 21st amino acid, selenocysteine. Selenocysteine (Sec) is directly synthesized onto its cognate tRNA (tRNA[Ser]Sec or tRNASec) and inserted into selenoproteins co-translationally with the help of various cis- and trans-acting factors. Among those factors, SecP43 has been reported to possibly play an essential role in the methylation at the 2’-hydroxylribosyl moiety in the wobble position (Um34) of Sec-tRNA[Ser]Sec and consequently reduce the expression of glutathione peroxidase 1. SecP43 also called tRNASec-associated protein has also been reported to interact in with SepSecS and tRNASec in vivo and the targeted removal of one of these proteins affected the binding of the other to the Sec-tRNASec. The initial aim of the project was to solve the structure of SecP43 by means of x-ray crystallography. Secondly, we were interested in characterizing the interaction of the latter with some of the components of the selenocysteine insertion machinery. These factors are SepSecS and tRNASec. We were able to optimize the expression and the purification of soluble form of the human homologue of SecP43 and of SepSecS by using an adapted auto-induction protocol. This was a major challenge considering that full length SecP43 has not been expressed and purify to date. We did not succeed in crystallizing SecP43. Our failure to crystallize SecP43 is probably due to the fact that it is a partially folded protein as we were able to demonstrate by SAXS (Small Angle X-ray Scattering). The SecP43 envelope calculated by SAXS displayed a rod-shape like structure. In order to enhance the stability of SecP43 required for crystallization, binding affinity studies were conducted to characterize the interaction between SecP43, tRNASec and SepSecS. We did not detect an interaction between SecP43 and tRNASec by using EMSA (Electrophoretic Mobility Shift Assay) and gel filtration. We also could not detect an interaction between SecP43 and SepSecS using a cross-linking assay. In contrast, the tRNASec/SepSecS interaction was demonstrated by EMSA and the addition of SecP43 seemed to reduce the binding affinity. Therefore, SecP43 might induce a conformational change in SepSecS in the presence of tRNASec. / Les sélénoprotéines sont des protéines contenant du sélénium sous la forme du 21ème acide aminé, la sélénocystéine. Sélénocystéine (Sec) est synthétisé sur son ARNt (ARNt[Ser]Sec ou ARNtSec) et inséré dans les sélénoprotéines de manière co-traductionnelle, avec l'aide de divers facteurs agissant en cis et en trans. Parmi ces facteurs, SecP43 joue possiblement un rôle dans la méthylation du groupement 2'- hydroxylribosyl dans la position d'oscillation (Um34) du Sec-ARNt[Ser]Sec et par conséquent, l’inhibition de SecP43 réduit l'expression de la glutathion peroxydase 1. L’interaction SecP43/ARNtSec/SepSecS a été démontrée in vivo et le retrait ciblé d’une de ces protéines affecte la liaison de l’autre à Sec-ARNtSec. L'objectif initial du projet était de résoudre la structure de SecP43 par cristallographie. En second lieu, nous avons voulu caractériser l’interaction de ce dernier avec certaines composantes de la machinerie d'insertion de la sélénocystéine. Ces facteurs sont notamment SepSecS et ARNtSec. Nous avons optimisé la surexpression et la purification des homologues humains de SecP43 et SepSecS en utilisant un protocole d'auto-induction. Ce fut un défi majeur étant donné que SecP43 n'avait pas encore été surexprimée et purifiée à ce jour. Nous n'avons pas réussi à cristalliser SecP43. Cet échec s’explique probablement par le fait que SecP43 est une protéine dynamique et partiellement replié comme nous avons pu le démontrer par SAXS (Small Angle X-ray Scattering). L'enveloppe de SecP43 calculée par SAXS présente une structure filiforme et non globulaire. Afin d'améliorer la stabilité de SecP43 requise pour la cristallisation, des études d'affinité de liaison ont été conduites pour caractériser les interactions entre SecP43, ARNtSec et SepSecS. Aucune interaction substantielle n’a pu être démontrée entre SecP43 et ARNtSec par retard sur gel ou par chromatographie d’exclusion stérique. Le même constat fut fait pour l’interaction SecP43/SepSecS. En revanche, l’interaction ARNtSec/SepSecS a été démontrée par EMSA (Electrophoretic Mobility Shift Assay) et l'addition de SecP43 semble réduire l'affinité de liaison de ladite interaction. Par conséquent, SecP43 induirait un changement conformationel de SepSecS en présence du ARNtSec.

Les sélénoprotéines sont des protéines auxquelles des sélénocystéines, soit le 21e acide aminé, sont incorporées durant leur traduction. Plus précisément, la sélénocystéine (Sec) est un dérivé métabolique de la sérine, mais structurellement équivalent à une cystéine dont on a remplacé l'atome de soufre par du sélénium. Elle se distingue des autres acides aminés puisqu’elle possède sa propre synthétase qui sert à convertir la sérine en Sec alors que le résidu est déjà fixé à l’ARNt. La position d’une Sec sur l’ARNm est indiquée par le codon UGA étant habituellement un signal STOP introduisant le concept de recoding. Grâce à une machinerie métabolique spécifique à l'ARNtSec et à la présence d’un SecIS (Selenocystein Insertion Sequence) sur l’ARNm, ce codon permet la présence d'une Sec dans la protéine. Il est connu que la synthèse débute avec l’acétylation de l’ARNt[Ser]Sec par la seryl-ARNt synthétase (SerRS) afin de donner la seryl-ARNt[Ser]Sec. Cette dernière est subséquemment phosphorylée par l’O-phosphoséryl-ARNt[Ser]Sec kinase (PSTK) qui donnera l’O-phosphoséryl-ARNt[Ser]Sec. Par la suite, un complexe de plusieurs protéines et cofacteurs, agissant comme machinerie pour l’incorporation des Sec durant la traduction, s’associe avec l’ARNt[Ser]Sec puis l’ARNm et, finalement, les composantes du ribosome. Parmi ces protéines, SepSecS catalyse l’étape finale de la synthèse des Sec en convertissant le O-phosphoseryl-ARNt[Ser]Sec en selenocysteinyl-ARNt[Ser]Sec utilisant le sélénophosphate comme source de sélénium. Des études récentes montrent que l’association avec SECp43 serait nécessaire pour que SepSecS joue son rôle et soit ségrégée au noyau pour s’associer à la machinerie de biosynthèse des sélénoprotéines, soit le complexe moléculaire qui reconnaît le codon UGA. Parmi les protéines de la machinerie de biosynthèse des sélénoprotéines que nous avons analysées, il y a eEFSec, RPL30, SPS2, SPS1, SBP2 et NSEP1. Nos résultats d’analyse de la dynamique de l’interaction entre les constituants de la machinerie de biosynthèse et d’incorporation des Sec, confirment plusieurs données de la littérature, mais remettent en question le modèle jusqu’à maintenant établi. Une meilleure compréhension de la dynamique des interactions entre ses constituants et la régulation de cette dynamique permet d’émettre des hypothèses quant au rôle de la machinerie de biosynthèse des sélénoprotéines et de l’importance de sa complexité. Nous avons analysé les interactions in vivo dans des cellules HEK293T au moyen de la technique de Protein-Fragment Complementation Assay (PCA) en couplant, par un clonage moléculaire, les gènes de chacune des protéines d’intérêt avec des fragments des gènes de la protéine luciférase (hRluc). Nous avons ainsi réalisé une fusion en N-terminal et en C-terminal des fragments de luciférase pour chacune des protéines d’intérêt. Puis, nous avons analysé la dynamique des interactions avec les composantes de la machinerie de biosynthèse des Sec. D’autres travaux seront essentiels afin de bâtir sur les résultats présentés dans cette recherche. / Selenoproteins are proteins that incorporate selenocysteines, which is called the 21st amino acid, during their translation. Specifically, selenocysteine (Sec) is a metabolic derivate of serine, which is structurally equivalent to Cys except for replacement of sulfur with an atom of selenium in the δ-position. It differs from other amino acids since a unique synthetase converts the serine into Sec while the residue is already attached to the tRNA. The codon for Sec on the mRNA is a UGA codon that is usually a STOP signal, introducing the concept of "recoding". Through a specific metabolic machinery for the tRNASec and the presence of a SecIS (Selenocysteine Insertion Sequence) on the mRNA, this codon allows the incorporation of the Sec into the protein. However, the mechanism of biosynthesis of this amino acid and its incorporation into proteins is not well understood. It is known that the synthesis starts with the acetylation of tRNA[Ser]Sec by seryl-tRNA synthetase (SerRS) to give the seryl-tRNA[Ser]Sec. The latter is subsequently phosphorylated by the O-phosphoseryl-tRNA[Ser]Sec kinase (PSTK) which will generate the O-phosphoseryl-tRNA[Ser]Sec. Subsequently, a large complex of several proteins and cofactors acting as machinery for incorporation of Sec during translation, associates with tRNA[Ser]Sec and the mRNA and finally, the components of the ribosome. Among these proteins, SepSecS catalyzes the final step in the biosynthesis of Sec converting O-phosphoseryl-tRNA[Ser]Sec into selenocysteinyl-tRNA[Ser]Sec using monoselenophosphate as a source of selenium. Recent studies showed that the association with SECp43 would be required for SepSecS to play its role to segregate into the nucleus to be associated with the machinery that recognizes the UGA codon. Among the proteins of the biosynthesis machinery of selenoproteins that we analyzed, there are eEFSec, RPL30, SPS2, SPS1, SBP2 and NSEP1. Results of analysis of the dynamics of the interaction between the components of the Sec biosynthetic machinery confirm some data from the literature, but conflict with the model so far established. A better understanding of the dynamics of interactions between its constituents and the reaction of this process would allow us to make assumptions about the role of the biosynthetic machinery of selenoproteins and the importance of its complexity. We analyzed the dynamics of interaction in vivo in HEK293T cells using a Protein-Fragment Complementation Assay (PCA) based on a humanized Renilla luciferase (hRLuc) by coupling, by molecular cloning, genes encoding each protein of interest with gene encoding fragments of the luciferase protein (hRluc). We have thus achieved an expression of fusion of N-terminal and C-terminal fragments for each luciferase protein of interest. Then, we analyzed the dynamics of the interaction with the components of the Sec biosynthetic machinery. Further work will be essential to build on the results presented in this research.

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Les sélénoprotéines sont des protéines auxquelles des sélénocystéines, soit le 21e acide aminé, sont incorporées durant leur traduction. Plus précisément, la sélénocystéine (Sec) est un dérivé métabolique de la sérine, mais structurellement équivalent à une cystéine dont on a remplacé l'atome de soufre par du sélénium. Elle se distingue des autres acides aminés puisqu’elle possède sa propre synthétase qui sert à convertir la sérine en Sec alors que le résidu est déjà fixé à l’ARNt. La position d’une Sec sur l’ARNm est indiquée par le codon UGA étant habituellement un signal STOP introduisant le concept de recoding. Grâce à une machinerie métabolique spécifique à l'ARNtSec et à la présence d’un SecIS (Selenocystein Insertion Sequence) sur l’ARNm, ce codon permet la présence d'une Sec dans la protéine. Il est connu que la synthèse débute avec l’acétylation de l’ARNt[Ser]Sec par la seryl-ARNt synthétase (SerRS) afin de donner la seryl-ARNt[Ser]Sec. Cette dernière est subséquemment phosphorylée par l’O-phosphoséryl-ARNt[Ser]Sec kinase (PSTK) qui donnera l’O-phosphoséryl-ARNt[Ser]Sec. Par la suite, un complexe de plusieurs protéines et cofacteurs, agissant comme machinerie pour l’incorporation des Sec durant la traduction, s’associe avec l’ARNt[Ser]Sec puis l’ARNm et, finalement, les composantes du ribosome. Parmi ces protéines, SepSecS catalyse l’étape finale de la synthèse des Sec en convertissant le O-phosphoseryl-ARNt[Ser]Sec en selenocysteinyl-ARNt[Ser]Sec utilisant le sélénophosphate comme source de sélénium. Des études récentes montrent que l’association avec SECp43 serait nécessaire pour que SepSecS joue son rôle et soit ségrégée au noyau pour s’associer à la machinerie de biosynthèse des sélénoprotéines, soit le complexe moléculaire qui reconnaît le codon UGA. Parmi les protéines de la machinerie de biosynthèse des sélénoprotéines que nous avons analysées, il y a eEFSec, RPL30, SPS2, SPS1, SBP2 et NSEP1. Nos résultats d’analyse de la dynamique de l’interaction entre les constituants de la machinerie de biosynthèse et d’incorporation des Sec, confirment plusieurs données de la littérature, mais remettent en question le modèle jusqu’à maintenant établi. Une meilleure compréhension de la dynamique des interactions entre ses constituants et la régulation de cette dynamique permet d’émettre des hypothèses quant au rôle de la machinerie de biosynthèse des sélénoprotéines et de l’importance de sa complexité. Nous avons analysé les interactions in vivo dans des cellules HEK293T au moyen de la technique de Protein-Fragment Complementation Assay (PCA) en couplant, par un clonage moléculaire, les gènes de chacune des protéines d’intérêt avec des fragments des gènes de la protéine luciférase (hRluc). Nous avons ainsi réalisé une fusion en N-terminal et en C-terminal des fragments de luciférase pour chacune des protéines d’intérêt. Puis, nous avons analysé la dynamique des interactions avec les composantes de la machinerie de biosynthèse des Sec. D’autres travaux seront essentiels afin de bâtir sur les résultats présentés dans cette recherche. / Selenoproteins are proteins that incorporate selenocysteines, which is called the 21st amino acid, during their translation. Specifically, selenocysteine (Sec) is a metabolic derivate of serine, which is structurally equivalent to Cys except for replacement of sulfur with an atom of selenium in the δ-position. It differs from other amino acids since a unique synthetase converts the serine into Sec while the residue is already attached to the tRNA. The codon for Sec on the mRNA is a UGA codon that is usually a STOP signal, introducing the concept of "recoding". Through a specific metabolic machinery for the tRNASec and the presence of a SecIS (Selenocysteine Insertion Sequence) on the mRNA, this codon allows the incorporation of the Sec into the protein. However, the mechanism of biosynthesis of this amino acid and its incorporation into proteins is not well understood. It is known that the synthesis starts with the acetylation of tRNA[Ser]Sec by seryl-tRNA synthetase (SerRS) to give the seryl-tRNA[Ser]Sec. The latter is subsequently phosphorylated by the O-phosphoseryl-tRNA[Ser]Sec kinase (PSTK) which will generate the O-phosphoseryl-tRNA[Ser]Sec. Subsequently, a large complex of several proteins and cofactors acting as machinery for incorporation of Sec during translation, associates with tRNA[Ser]Sec and the mRNA and finally, the components of the ribosome. Among these proteins, SepSecS catalyzes the final step in the biosynthesis of Sec converting O-phosphoseryl-tRNA[Ser]Sec into selenocysteinyl-tRNA[Ser]Sec using monoselenophosphate as a source of selenium. Recent studies showed that the association with SECp43 would be required for SepSecS to play its role to segregate into the nucleus to be associated with the machinery that recognizes the UGA codon. Among the proteins of the biosynthesis machinery of selenoproteins that we analyzed, there are eEFSec, RPL30, SPS2, SPS1, SBP2 and NSEP1. Results of analysis of the dynamics of the interaction between the components of the Sec biosynthetic machinery confirm some data from the literature, but conflict with the model so far established. A better understanding of the dynamics of interactions between its constituents and the reaction of this process would allow us to make assumptions about the role of the biosynthetic machinery of selenoproteins and the importance of its complexity. We analyzed the dynamics of interaction in vivo in HEK293T cells using a Protein-Fragment Complementation Assay (PCA) based on a humanized Renilla luciferase (hRLuc) by coupling, by molecular cloning, genes encoding each protein of interest with gene encoding fragments of the luciferase protein (hRluc). We have thus achieved an expression of fusion of N-terminal and C-terminal fragments for each luciferase protein of interest. Then, we analyzed the dynamics of the interaction with the components of the Sec biosynthetic machinery. Further work will be essential to build on the results presented in this research.