Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / O lÃtex da planta medicinal Calotropis procera (Apocynaceae) possui molÃculas com diferentes atividades farmacolÃgicas, dentre estas, prÃ- e antiinflamatÃria. Neste trabalho, o efeito imunomodulatÃrio da fraÃÃo de proteÃnas solÃveis do lÃtex (PL) foi investigado em modelos experimentais de sepse induzida por CLP e por inoculaÃÃo de S. Typhimurium. Aspectos bioquÃmicos das proteÃnas do lÃtex foram investigados e parÃmetros bioquÃmicos, hematolÃgicos e histopatolÃgicos foram determinados em animais experimentais. PL exibiu um significativo efeito protetor nos animais. Uma dose de 30 mg/Kg levou à sobrevivÃncia de atà 100%, comparada com 100% de mortalidade no grupo de animais infectados e nÃo tratados (grupo Salmonella). Este efeito foi somente observado quando PL foi administrado 24 horas antes da induÃÃo da sepse. PL nÃo apresentou atividade antibacteriana in vitro sugerindo um mecanismo de aÃÃo indireto, possivelmente intervindo nos processos imunes. A populaÃÃo microbiana no fÃgado, baÃo e fluido peritoneal - local do foco infeccioso - estava similar entre todos os grupos, 4 e 24 horas apÃs inoculaÃÃo bacteriana. No sangue, entretanto, a quantidade de bactÃrias viÃveis estava reduzida apenas nos animais tratados com proteÃnas do lÃtex. O efeito protetor de PL foi revisto atravÃs de suas trÃs sub-fraÃÃes protÃicas, denominadas de PI, PII e PIII, obtidas atravÃs de fracionamento por cromatografia de troca iÃnica em coluna de CM-Sepharose a pH 5,0. As trÃs sub-fraÃÃes protÃicas apresentaram efeito protetor e de forma similar. Nem o tratamento tÃrmico de PL (100 ÂC, 30 min.) ou inibiÃÃo de suas proteases endÃgenas com iodoacetamida alterou o efeito protetor observado. O Ãxido nÃtrico (NO), um importante sinalizador molecular, estava aumentado no soro de animais do grupo Salmonella enquanto que animais protegidos com doses de PL e PI apresentaram nÃveis similares ao controle apÃs 24 horas da infecÃÃo. Este resultado corroborou com a observaÃÃo de que animais com sepse letal apresentaram falÃncia na migraÃÃo de neutrÃfilos para o foco infeccioso enquanto que, de forma evidente, animais tratados com PL ou PI favoreceram o influxo de cÃlulas para a cavidade peritoneal. AlÃm disto, nestes animais, o nÃvel de NO estava aumentado no foco infeccioso, uma provÃvel atividade dos neutrÃfilos presentes como parte de sua atividade microbicida. A atividade da adenosina desaminase (ADA) mensurada no foco infeccioso, apÃs 4 e 24 horas de infecÃÃo, estava aumentada apenas nos animais tratados com PL ou PI, e inalterada em animais do grupo Salmonella. Plaquetopenia foi observada em animais com sepse, mas nÃo em animais protegidos com PL ou PI. Neutrofilia e linfopenia ocorreram em animais do grupo Salmonella. Neutrofilia seria concordante com o elevado teor de NO, um inibidor da migraÃÃo de neutrÃfilos, enquanto que a linfopenia à parte da imunossupressÃo estabelecida na sepse. Em animais tratados com PL ou PI foi observada neutrofilia sete dias apÃs a infecÃÃo, sugerindo um estÃmulo na hematopoiese. Linfopenia, observada no inÃcio da sepse (24 h), sà ocorreu aos sete dias nos animais tratados com PL ou PI. Atividade de transaminase glutÃmico oxalacÃtica estava aumentada em todos os grupos. Transaminase glutÃmico pirÃvica nÃo teve atividade alterada. A atividade da lactato desidrogenase estava aumentada em todos os grupos. AnÃlises histopatolÃgicas do fÃgado e baÃo mostraram que os danos teciduais causados pela sepse foram retardados nos animais tratados com PL, como observado apÃs sete dias. A anÃlise integrada de todos os resultados sugere que as proteÃnas do lÃtex modulam a resposta imunoinflamatÃria por mecanismo indireto, revertendo à falÃncia da migraÃÃo de neutrÃfilos causada pela sepse letal e, desta forma, induzem uma resposta imunolÃgica ainda nÃo esclarecida, que permite a sobrevivÃncia dos animais, mesmo sob infecÃÃo. Os resultados sugerem que a modulaÃÃo de NO estaria diretamente envolvida no efeito protetor final observado. As propriedades farmacolÃgicas de PL previamente descritas em modelos clÃssicos de inflamaÃÃo sÃo agora confirmadas em um modelo de resposta inflamatÃria sistÃmica resultante de um processo infeccioso previamente estabelecido. / Latex of the medicinal plant Calotropis procera (Apocynaceae) possesses molecules displaying different pharmacological activities, including pro- and anti-inflammatory. In this study immune inflammatory modulation of the soluble protein fraction (LP) recovered from the latex was investigated in experimental models of sepsis induced by CLP and inoculation of the S. Typhimurium. Biochemical aspects of laticifers proteins were investigated and biochemical, pharmacological and histopathological parameters were evaluated in experimental animals. LP protected animals and a unique dose (30 mg/Kg; i.p.) lead to 100% survival while non-treated infected animals (Salmonella group) reached 100% mortality within 24 h. Protection was only observed when LP was given 24 earlier of infection. LP did not exhibit in vitro bactericide activity suggesting indirect mechanism of action, probably by immune modulation. After 4 and 24 h of infection bacteria was similarly disseminated in liver, spleen and peritoneal fluid, local of bacteria inoculum. However, in blood viable bacteria was reduced only in animals given laticifers proteins. The protective effect of LP was also observed in its three sub-fraction, denominated of PI, PII and PIII, obtained after protein fractionation by ion exchange chromatography on a CM-Sepharose performed at pH 5.0. Neither, heat-treatment (100 C, 30 min) nor inhibition of its endogenous proteolytic enzymes, by iodoacetamide, eliminated the protective effect of LP. Nitric oxide (NO) an important signaling molecule was augmented in serum of non-treated animals whereas it was unaltered in control and LP/PI-treated animals 24 h after infection. Increasing of NO in serum is known to directly contribute to inhibit neutrophil migration in septic animals. Accordingly, failure of neutrophil migration to the infectious focus in septic animals was confirmed. Conversely, in animals given LP and PI, influx of neutrophils was evident. In addition, NO was also elevated in the infectious focus of LP/PI treated animals, probably due neutrophil activity as part of their microbicidal activity. Activity of adenosine deaminase (ADA) was measured locally after 4 and 24 h of infection was initiated. ADA was augmented in LP/PI treated animals and unaltered in non treated animals. Thrombocytopenia was observed in non treated animals but not in LP/PI protected animals. Neutrophilia and lymphopenia were documented in non-treated animals. Neutrophilia would result of high NO content in serum, which inhibits neutrophil migration and lymphopenia is part of immune suppression caused by sepsis. Neutrophilia was observed 7 days after infection in animals given LP/PI, suggesting a hematopoiesis stimulus. Lymphopenia first observed (24 h) in septic animals was only detected after 7 days in PL/PI treated animals. Activity of oxalacetic-glutamic transaminase was altered in all groups while glutamic-pyruvic transaminase not. Lactate dehydrogenase was augmented in all groups. Histopathological examination of liver and spleen revealed tissue damage caused by sepsis, but these alterations appeared later (7 days) in PL/PI-treated animals. Results reported in this study suggest that PL modulates immune inflammatory activity in septic animals by an indirect mechanism that remains to be investigated. Activity of LP leads to animal survival, even under infection. It is proposed that LP modulates NO synthesis, reducing NO levels in serum of infected animals and abolishing the failure of neutrophil migration. The pharmacological properties of LP previously described in classical models of inflammation, is now confirmed in a model of systemic inflammatory response elicited by microbial infection.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:www.teses.ufc.br:3222 |
| Date | 26 February 2010 |
| Creators | Raquel Sombra BasÃlio de Oliveira |
| Contributors | MÃrcio Viana Ramos |
| Publisher | Universidade Federal do CearÃ, Programa de PÃs-GraduaÃÃo em BioquÃmica, UFC, BR |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Format | application/pdf |
| Source | reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da UFC, instname:Universidade Federal do Ceará, instacron:UFC |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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