As modificações das lipoproteínas de baixa densidade (LDL) são uma etapa essencial na aterogênese pois acarretam a geração de LDL eletronegativa [LDL(-)] que apresenta propriedades quimiotática, citotóxica, imunogênica e pró-inflamatória. O objetivo deste trabalho foi a produção de hibridomas secretores de anticorpos monoclonais anti-LDL(-), a clonagem dos genes que codificam para as cadeias variáveis destes anticorpos, e sua expressão como fragmentos de anticorpo de cadeia única (scFv). A LDL(-) isolada de plasma humano foi utilizada como antígeno para imunização de camundongos BALB/c. Após triagem dos clones, dois anticorpos monoclonais foram obtidos baseados em sua reatividade pela LDL( -) e não pela LDL nativa: 1A3H2 (1A3) e 2C7D5F10 (2C7). Os cDNAs codificante para a cadeia pesada (VH) e cadeia leve (VL), de ambos os anticorpos, foram obtidos por meio de RT-PCR utilizando bibliotecas de oligonucleotídeos que reconhecem todas os genes de domínios variáveis das famílias de VH e VL murinas. Os genes da VH e VL obtidos foram clonados no vetor pGEM-T Easy (Promega®) e suas seqüências determinadas. A VH do anti-LDL(-) 1A3 pertence família J558.84 e fragmento gênico JH2, enquanto sua VL pertence a família 8.24 e fragmento gênico Jk5. A VH do anti¬-LDL(-) 2C7 pertence a família Vmu 3.2 (J558) e fragmento gênico JH4, enquanto sua VL pertence a família 8.24 e fragmento gênico Jk5. A partir disso, oligonucleotídeos sintéticos foram sintetizados a fim de clonar estes segmentos gênicos no vetor pPlgLE de expressão em Pichia pastoris. Foram realizadas três construções: o scFv 1A3, scFV 2C7 e um scFv híbrido (VH do 1A3 e VL do 2C7). Das três construções obtidas, conseguimos expressar o scFv do anti-LDL 2C7D5F10 que demonstrou ser capaz de reconhecer o antígeno. A proteína recombinante expressa tem grande potencial de ser usada no diagnóstico clínico incluindo imunoensaios in vitro e como reagentes para exames que envolvam a obtenção e análise de imagens. / Oxidative modification of low-density lipoproteins (LDL) is an essential step in atherogenesis, generating electronegative LDL [LDL(-)], which has chemotactic cytotoxic, immunogenic and proinflammatory properties. The aim of this study was the generation of anti-LDL(-) mAbs, the cloning of the genes that code for their variable domains and their expression as single-chain Fv (scFv). LDL(-) was isolated from human blood plasma and used as an antigen for immunization of Balb/c mice. Upon screening, two different mAbs were selected based on their ability to recognize LDL(-) and not native LDL: 1A3H2 (1A3) e 2C705F10 (2C7). The cDNAs that code for VH and VL were obtained by RT-PCR using specific immunoglobulin primer libraries wich recognize all VH and VL murine families. The VH and VL genes were cloned in pGEM-T Easy (Promega®) and sequenced. The anti-LDL(-) 1A3 uses a VH segment from J558.84 and a JH2 segment, while VL uses a 8.24/Jk5 segments. The anti-LDL(-) 2C7 uses a VH segment from Vmu 3.2 (J558) and a JH4 segment, while VL uses a 8.24/Jk5 segments. Oligonucleotides were synthetized and those gene segments were cloned in pPIGLE a Pichia pastoris immunoglobulin expression vector. We obtained three scFv constructions: scFV 1A3, scFv 2C7 and a husk hybrid, harboring 1A3 VH and 2C7 VL. Among those, we expressed the scFv anti¬-LDL(-) 2C7 that are able to recognize the antigen. The recombinant protein has a great potential for clinicai diagnostic applications, including in vitro immunoassays and as imaging reagents.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-29092017-110802 |
| Date | 08 April 2008 |
| Creators | Telles, Andréia Elisa Rodrigues |
| Contributors | Abdalla, Dulcineia Saes Parra |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | Dissertação de Mestrado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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