Doctor en Farmacología / Autorizada por el autor, pero con restricción para ser publicada a texto completo en el Portal de tesis, hasta enero de 2017 / La Serotonina (5-HT) es un neurotransmisor detectado tempranamente durante el desarrollo del
sistema nervioso central y recientemente se ha descrito su papel sobre los procesos de migración
y morfología neuronal. Mediante la inhibición farmacológica de la síntesis de 5-HT durante el
desarrollo embrionario, se ha determinado que la reducción en este neurotransmisor produce
efectos a largo plazo reflejado en una disminución del peso del cerebro, alteración en la
maduración neuronal y una disminución de la complejidad dendrítica.
La 5-HT ejerce sus acciones a través de sus receptores ionotrópicos (5HT3) y metabotrópicos
(5HT1, 5HT2, 5HT4-5HT7). Algunos de ellos se expresan tempranamente durante el desarrollo
embrionario y más aún puede variar su distribución y/o niveles en forma dinámica durante el
desarrollo pre y posnatal. Para efectos de esta Tesis se destacan los receptores 5HT1A y 5HT7 los
cuales están presentes en estructuras cerebrales como el hipocampo. Interesantemente, el
5HT1A-R se expresa tempranamente durante el desarrollo embrionario; por lo cual se postula
que la 5-HT tendría un efecto modulador sobre la migración, diferenciación y viabilidad celular.
En cambio, solo se ha descrito una expresión dinámica del 5HT7-R durante el desarrollo
posnatal; lo que sugiere una acción de este receptor en estadíos bien definidos.
La sobre-expresión de los receptores serotoninérgicos 5HT1A y 5HT7 en líneas celulares, ha
permitido estudiar su acoplamiento a distintas cascadas transduccionales. Se ha descrito el
acoplamiento a diversas proteínas G que permiten la activación o inhibición de proteínas
efectoras como AC, fosfolipasas, regulación de canales iónicos y activación de las vías MAPK y
PI3K-Akt, entre otras. Estas vías participan promoviendo la formación de neuritas y dendritas y
han sido involucradas con la regulación de la plasticidad sináptica. En contraste, los efectores de
estos receptores descritos en líneas celulares no han sido bien definidos en neuronas. Si bien
existen algunos antecedentes que apoyan la idea de que la 5-HT regula la morfología neuronal,
no se ha establecido la participación de un subtipo de receptor en particular. La activación del
5HT1A-R induce un aumento en el número y largo de neuritas en neuroblastoma de ratón. En
relación a estos cambios morfológicos, se ha descrito que la vía de las Rho GTPasas regula el
citoesqueleto a través de la modulación de la cofilina, importante regulador del citoesqueleto de
actina. Se ha demostrado un acoplamiento entre el 5HT7-R y Gα12 y el aumento del crecimiento
de neuritas en neuronas hipocampales, aunque no se ha dilucidado cuáles son sus efectores río
abajo.
De acuerdo a estos antecedentes se postuló la siguiente hipótesis: “Agonistas de los receptores
5HT1A y 5HT7 activan vías transduccionales que modulan el citoesqueleto, efectos que se
asocian a cambios morfológicos de neuronas hipocampales en cultivos”. Los objetivos fueron:
1) Determinar en neuronas hipocampales con distinta madurez, el efecto de agonistas de los
receptores serotoninérgicos 5HT1A y 5HT7 sobre proteínas que participan en vías
transduccionales, que tienen como blanco el citoesqueleto de microtúbulos y de actina, como
Akt-GSK-3β, ERK y cofilina, respectivamente. 2) Determinar el efecto de agonistas de los
receptores serotoninérgicos 5HT1A y 5HT7 sobre la morfología de neuronas hipocampales con
distinta madurez. Estos objetivos se desarrollaron utilizando antagonistas específicos para los
receptores 5HT1A (WAY-100635) y 5HT7 (SB269970). En esta tesis se demostró que la
distribución del receptor 5HT1A experimenta una polarización a mayor madurez del cultivo,
encontrándose tempranamente en el soma y más tardíamente con una localización somato-dendrítica, sin variar el nivel del receptor. En contraste, la distribución somato-dendrítica del
5HT7-R fue independiente de la madurez del cultivo. A su vez, se detectaron las isoformas
5HT7a-R y 5HT7b-R y cuya relación no varió durante los días del cultivo in vitro (DIV). No
obstante, ambas isoformas aumentan significativamente entre los 2 y 14 DIV. El 8OH-DPAT,
agonista de los receptores 5HT1A (Ki 10 nM) y 5HT7 (Ki 52 nM), promueve la activación de la
vía Akt-GSK-3β a los 2 DIV, efecto que involucraría la participación del 5HT7-R y,
probablemente al 5HT1A-R. Adicionalmente, el 8OH-DPAT en neuronas más maduras (7 DIV),
aumentó la activación de la Akt, efecto independiente de los receptores 5HT1A y 5HT7. Estos
resultados sugieren que este agonista puede activar a otros receptores, lo que plantea una
reevaluación de su acción como agonista selectivo del 5HT1A. Por otra parte, a pesar de la
activación de la Akt, no se observaron cambios en la fosforilación de la GSK-3β, sugiriendo una
disociación de ambas quinasas a este estadío. Adicionalmente, el 8OH-DPAT ó la 5-HT no
modificaron significativamente el estado de fosforilación de las ERK1/2.
La estimulación durante 24 horas con 8OH-DPAT en neuronas con 2 DIV aumentó
significativamente el número de las neuritas primarias, acompañado de un aumento en el largo
neurítico total; efectos no asociados a los receptores 5HT1A y 5HT7. Estos resultados sugieren
que el 8OH-DPAT activa un receptor que incrementa el número de neuritas sin afectar su largo.
Interesantemente, se observó que la estimulación con 8OH-DPAT disminuyó significativamente
la fosforilación inactivante de la cofilina en Ser3; efecto insensible a la acción de los antagonistas
de los receptores 5HT1A y 5HT7. Similarmente, a los 7 DIV se observó una disminución
significativa de los niveles fosforilados de cofilina luego de la estimulación con 5-HT, efecto no
asociado a los receptores 5HT1A y 5HT7, sugiriendo la participación de un receptor
serotoninérgico desconocido sobre la dinámica de actina.
Adicionalmente, la activación del 5HT7-R con 8OH-DPAT y 5HT a los 2 DIV durante 24 h
disminuye el número de las dendritas primarias pero promueve el crecimiento. A este mismo
estadío neuronal, la 5-HT a través de 5HT1A-R y 5HT7-R aumentó el crecimiento de dendritas
secundarias. Por otro lado, se demostró a los 8 DIV que la 5-HT aumenta el número de
dendritas primarias más cortas a través de un receptor serotoninérgico desconocido.
Adicionalmente, los cambios inducidos por la 5-HT a los 8 DIV, indican que el 5HT1A-R
promueve una reducción en el largo de las dendritas primarias, fenómeno observado por la
reducción en el número de las dendritas primarias más largas (> 40 μm); efecto también
observado en las secundarias más largas (> 20 μm). En apoyo, el análisis de Sholl muestra una
disminución de la complejidad neuronal asociada a este receptor. Es decir, el 5HT1A-R inhibe el
crecimiento y la complejidad dendrítica, probablemente al frenar el crecimiento o elongación de
éstas, quedando por establecer los mecanismos moleculares asociados. En apoyo a este hallazgo,
se ha descrito recientemente en hipocampo de ratón adulto que el 5HT1A-R produce una
disminución de las dendritas terciarias. En contraste, a los 8 DIV el 5HT7-R promueve un
aumento del crecimiento de dendritas primarias y secundarias, siendo este último efecto también
observado por la estimulación del 5HT1A-R. En resumen, el 5HT1A-R promueve una disminución
de la complejidad dendrítica, en contraste al efecto positivo de la activación del 5HT7-R
observado a nivel de las neuritas y dendritas; sugiriendo que estos receptores pueden modular la
morfología neuronal de forma diferencial dependiendo de la madurez del cultivo. Además, por
primera vez se involucra la participación de los receptores 5HT1A y 5HT7 sobre la morfología
neuronal en cultivo primario de hipocampo de rata. Además, este estudio muestra los efectos de
agonistas serotoninérgicos sobre vías transduccionales relacionadas a la modulación del
citoesqueleto y cambios en la morfología que depende de la madurez de neuronas hipocampales. / Serotonin (5-HT) is a neurotransmitter found early during development of the central nervous
system and recently it has been involved in cell migration and neuronal morphology. The
pharmacological inhibition of 5-HT synthesis during embryonic development suggests that its
reduction produces long-term effects reflected as decreased brain weight, altered neuronal
maturation and reduction of dendritic complexity.
The 5-HT exerts its actions through ionotropic (5HT3) and metabotropic (5HT1, 5HT2,
5HT4-5HT7) receptors. Some of these receptors are expressed early during embryonic
development and their distribution or levels can change dynamically during pre-and postnatal
development. This thesis focuses on 5HT1A and 5HT7 receptors, which are present in brain
structures such as the hippocampus. Interestingly, the 5HT1A-R is expressed early during
embryonic development, suggesting that 5-HT could have a modulating effect on cell migration,
differentiation and viability. In contrast, a dynamics expression of 5HT7-R has been described
during postnatal development, suggesting a role in well-defined neuronal stages.
Overexpression of 5HT1A and 5HT7 serotonin receptors in cell lines has allowed studying their
coupling to several transduction pathways. These receptors are coupled to several G protein
allowing the activation or inhibition of effector proteins such as AC, phospholipases, regulation
of ion channels and activation of MAPK and PI3K-Akt, among others. These pathways promote
neurites and dendrites formation, and have been implicated in the regulation of synaptic
plasticity. In contrast, the effectors of these receptors described in cell lines have not been well
defined in neurons.
Although some evidences support the idea that 5-HT regulates neuronal morphology, it has not
been established which serotonergic receptors are involved. The 5HT1A-R activation induces an
increase in both the number and length of neurites in mouse neuroblastoma. In relation to these
morphological changes, it has been described that Rho GTPases pathway regulates the
cytoskeleton through the modulation of cofilin, an important regulator of actin dynamics.
Additionally, a link between 5HT7-R, activation of Gα12 and the increase of neurite outgrowth
in hippocampal neurons has been described, but it has not been elucidated the transduction
pathway involved.
According to these evidences, the following hypothesis was proposed: “Agonists of 5HT1A and
5HT7 receptors activate pathways that modulate the cytoskeleton, effects that are associated with
morphological changes in cultured hippocampal neurons." The aims were to: 1) Determine, the
effect of 5HT1A-R and 5HT7-R agonist on proteins involved in transduction pathways, targeting
microtubule and actin cytoskeleton like Akt-GSK- 3β, ERK and cofilin, respectively, on
hippocampal neurons with different maturity. 2) Determine the effect of 5HT1A-R and 5HT7-R
agonist on morphology of hippocampal neurons with different maturity. These objectives were
developed using specific antagonists of 5HT1A (WAY-100635) and 5HT7 (SB269970) receptors. In this thesis it was shown that the distribution of 5HT1A receptor undergoes a polarization
during the maturity of neurons, being early found in the soma and late with a somato-dendritic
distribution but without changes on receptor levels. In contrast, the somato-dendritic distribution
of 5HT7-R was independent of neuronal maturity. Besides, the isoforms “a” and “b” of 5HT7-R
were detected without changes in their ratio during days in vitro (DIV). Nonetheless, both
isoforms increased significantly from 2 to 14 DIV. The 8OH-DPAT, a 5HT1A (Ki 10 nM) and
5HT7 (Ki 52 nM) receptor agonist, promotes the activation of the Akt-GSK-3β pathway at 2
DIV, effect which involves the participation of 5HT7-R and probably the 5HT1A-R. Additionally,
in more mature neurons (7 DIV) stimulation with 8OH-DPAT increased activation of Akt, an
effect independent of 5HT1A and 5HT7 receptors. These results suggest that this agonist may
activate other receptors, and hence demands a reconsideration of its action as selective 5HT1A
agonist. Moreover, in spite of Akt activation, no changes were observed in the phosphorylation
levels of GSK-3β, suggesting dissociation of both kinases at this stage. Additionally, neither
8OH-DPAT nor 5-HT altered the phosphorylation levels of ERK1/2.
Stimulation for 24 hours with 8OH-DPAT at 2 DIV significantly increased the number of
primary neurites, accompanied by an increase in the overall length of neurites; effects which are
not related to 5HT1A and 5HT7 receptors. These evidences suggest that 8OH-DPAT targets an
unknown receptor whose activation increases the number of neurites without affecting their
length. Interestingly, it was observed that stimulation with 8OH-DPAT significantly decreased
the inactivating phosphorylation of cofilin in Ser3; an effect insensitive to the antagonists of the
5HT1A and 5HT7 receptors. Similarly, a significant decrease of phosphorylated cofilin levels
after stimulation with 5-HT was observed at 7 DIV; effect not associated to 5HT1A and 5HT7
receptors, suggesting the participation of an unknown serotonin receptor modulating actin
dynamics.
Additionally, the 5HT7-R activation with 8OH-DPAT and 5-HT at 2 DIV during 24 h decreases
the number of primary dendrites but promotes its growth. At this neuronal stage, 5-HT
stimulates secondary dendrite growth through both 5HT1A-R and 5HT7-R. Furthermore, this
thesis demonstrated at 8 DIV that 5-HT increases the number of short primary dendrites via an
unknown serotonergic receptor. Additionally, the changes induced by 5-HT at 8 DIV, indicate
that 5HT1A-R promotes a reduction in the length of the primary dendrites, a phenomenon
observed as reduction in the number of longer primary dendrites (> 40 um); effect also observed
in longer secondary dendrites (> 20 um). In accordance, Sholl analysis shows a decrease in
neuronal complexity associated with this receptor. Thus, 5HT1A-R inhibits primary dendritic
growth and complexity, probably by slowing the growth or elongation, and the molecular
mechanisms associated remains to be explained. In support of this finding, it has been recently
described in adult mouse hippocampus, that 5HT1A-R promotes a decrease of tertiary dendrites.
In contrast, this Thesis described that 5HT7-R induces an increased growth of primary and
secondary dendrites at 8 DIV; being the latter effect also observed by 5HT1A-R stimulation. To
summarize, the 5HT1A promotes a reduction of dendritic complexity in contrast to the positive
effect of 5HT7 receptors observed in both neurites and dendrites; suggesting that these receptors
differentially modulate the neuronal morphology depending on neuron maturity. Furthermore,
we described for first time the participation of 5HT1A and 5HT7 on neuronal morphology in
primary culture of rat hippocampal neurons. Additionally this study shows the effects of
serotonergic agonists on transduction pathways related to cytoskeleton modulation and
morphological changes depending on maturity of hippocampal neurons. / Conicyt
| Identifer | oai:union.ndltd.org:UCHILE/oai:repositorio.uchile.cl:2250/113597 |
| Date | January 2013 |
| Creators | Rojas Domínguez, Paulina Soledad |
| Contributors | Fiedler Temer, Jenny, Lavandero González, Sergio, Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas |
| Publisher | Universidad de Chile |
| Source Sets | Universidad de Chile |
| Language | Spanish |
| Detected Language | Spanish |
| Type | Tesis |
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