Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Neurociências. / Made available in DSpace on 2012-10-21T03:51:17Z (GMT). No. of bitstreams: 1 194756.pdf: 512946 bytes, checksum: 70bc24df372a2e7a107eb6b9ae3cdf97 (MD5) / Investigação da presença e a possível participação de receptores serotonérgicos da área pré-óptica no controle da ingestão de alimento e de água em pombos e caracterização dos subtipos de receptores envolvidos. Foram utilizados pombos adultos (Columba livia), com cânulas-guia cronicamente implantadas em regiões próximas à área pré-óptica permitindo injeções de antagonistas de receptores serotonérgicos 5-HT1/2, 5-HT2A e 5-HT2C, e agonistas de receptores 5-HT1A e 5-HT1B/1D. De maneira geral, este estudo apontou a participação de receptores 5-HT1B/1D presentes na área pré-óptica ventral de pombos na inibição tônica exercida pela serotonina sobre a ingestão de alimento, especialmente sobre os sinais que induzem à saciação; e não naqueles que levam à saciedade. Por outro lado, parece não haver envolvimento dos receptores serotonérgicos 5-HT1A e 5-HT2A/2C presentes na APV com a regulação neuronal da ingestão de alimento em pombos.

Personalidade e temperamento têm sido frequentemente associados aos transtornos de ansiedade. Considerando a predisposição e vulnerabilidade, os traços de personalidade têm sido investigados como um possível fenótipo intermediário aos transtornos de ansiedade em estudos de genética. Pacientes com Transtorno de Pânico (TP) apresentam elevados escores em Evitação de Dano (ED), temperamento caracterizado por Cloninger como timidez e comportamento inibido para novos estímulos, e neuroticismo, quando comparados com indivíduos sem patologia psiquiátrica, mesmo na fase assintomática da doença. O polimorfismo da região promotora do gene transportador de serotonina (5HTTLPR) tem sido investigado em estudos de associação, evidenciando forte correlação com neuroticismo. Recentemente, evidenciou-se que a forma longa do polimorfismo 5HTTLPR possui uma variação gênica (Lg) que está ligada à diminuição de sua expressividade. O presente trabalho teve como objetivo investigar a associação entre o temperamento, a personalidade e os fatores genéticos no TP.Na primeira etapa deste estudo participaram 135 pacientes com TP emparelhados por sexo e idade com 135 controles sem transtorno psiquiátrico avaliados através do M.I.N.I. (Mini International Neuropsychiatric Interview – Brazilian version 5.0.0 – DSM IV) – uma entrevista estruturada que avalia de modo padronizado os principais transtornos psiquiátricos do Eixo I, de acordo com os critérios do DSM-IV. Para avaliação da personalidade foi utilizado o Temperament and Character Inventory (TCI). Uma sub-amostra deste estudo (n=67) também foi avaliada através do Minnesota Multiphasic Personality VI Inventory (MMPI). Pacientes com TP apresentaram maiores escores na escala de temperamento ED e menores escores nas escalas de caráter Auto Direcionamento (AD) e Cooperatividade (C) quando comparado ao grupo controle. Uma correlação positiva entre o temperamento de ED do TCI e as escalas da tríade neurótica (Histeria, Depressão, Hipocondria) do MMPI foi encontrada, sugerindo que esses constructos se referem, ao menos em parte, a características de personalidade intercambiáveis. Em uma segunda etapa, este estudo avaliou a associação entre o polimorfismo 5-HTTLPR no sistema trialélico e traços de personalidade neuróticos (tríade neurótica Hs, D, Hy - MMPI) em 67 pacientes caucasóides com TP em remissão. O critério de remissão para este estudo foi CGI (Clinical Global Impression) ≤ 2 e ausência de ataques de pânico. A personalidade foi avaliada através do MMPI, com a classificação dos escores em patológico (≥ 70), alto (de 55 à 69) e normal ou baixo (≤ 54). Os genótipos dos pacientes foram agrupados pelo nível de expressividade: Baixa Expressividade (SS, SLg e LgLg), Expressividade Intermediária (SLa, LgLa) e Alta Expressividade (LaLa). Não houve desvio significativo do equilíbrio de Hardy Weinberg (χ²=0.52, df=1, p=0.471). De acordo com a classificação trialélica, a distribuição dos alelos nestes pacientes foi: S 58 (43.3%), Lg 17 (12.7%) e La 59 (44.0%). Não houve diferenças significativas nas escalas do MMPI entre as diferentes classificações dos genótipos e nas análises dos alelos nesse estudo. Esse estudo conta com algumas limitações, entretanto, representa um dos primeiros estudos de genética a investigar a associação do polimorfismo 5HTTPLR e traços de personalidade em pacientes com TP em uma amostra brasileira. No futuro, amostras maiores serão necessárias para excluir influências menores do gene nesses traços, assim como outros polimorfismos e a utilização de outros constructos deverão ser considerados na caracterização de um fenótipo herdável no TP.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Neurociências, Florianópolis, 2009. / Made available in DSpace on 2012-10-24T07:11:17Z (GMT). No. of bitstreams: 1 267283.pdf: 1324404 bytes, checksum: fb966aaea39f2adcbee5e380529431d2 (MD5) / O presente estudo examinou os efeitos da injeção local de metergolina (MET, antagonista de receptores 5-HT1 e 5-HT2; 0, 2 e 20nmol), 8-hidroxi-2-(di-n-propilamino)-tetralina (8-OH-DPAT, agonista de receptores 5-HT1A e 5-HT7; 0, 6 e 6nmol) e de 8-OH-DPAT (6nmol) em ratas pré-tratadas com maleato de ciclo hexano carboxamida n-[2-[4-(2-metoxifenil)-1-piperazinil]etil]-n-(2-piridinil) (WAY 100635, antagonista seletivo de receptor 5-HT1A, 37nmol) no núcleo arqueado (ARC) e na área hipotalâmica lateral (AHL), nos comportamentos ingestivos e não ingestivos de ratas. Estes efeitos foram examinados durante as fases de estro ou diestro e as ratas foram adaptadas com dieta enriquecida com sacarose 10% durante 1h, por 3 dias consecutivos, na caixa de experimento. Os resultados mostraram que a injeção de 8-OH-DPAT na AHL reduziu a ingestão de alimento em todas as doses e em ambas as fases do ciclo estral, enquanto que no ARC esse tratamento desencadeou uma resposta hipofágica, somente na maior dose de 8-OH-DPAT e apenas na fase de estro. A administração de MET (em todas as doses) no ARC não afetou a ingestão alimentar durante ambas as fases do ciclo estral examinadas. Ocorreu uma redução na ingestão de alimento após a injeção de ambas as doses de MET na AHL de ratas durante as fases de estro e diestro. Na fase de estro, a injeção da maior dose de 8-OH-DPAT no ARC e na AHL diminuiu a duração da ingestão de alimento. A latência para iniciar o consumo de alimento, a ingestão de água e de outros comportamentos não ingestivos não foi afetada pela administração de 8-OH-DPAT ou MET no ARC ou na AHL em ambas as fases do ciclo estral. O pré-tratamento com WAY 100635 na AHL bloqueou o efeito hipofágico desencadeado pela injeção de 8-OH-DPAT (6nmol) durante as fases de estro e diestro. O pré-tratamento com WAY 100635 no ARC bloqueou a resposta hipofágica, bem como a redução na duração do consumo de alimento desencadeado pela injeção de 8-OH-DPAT na fase de estro. A latência para iniciar a ingestão de alimento, ingestão de água, bem como a duração dos outros comportamentos não ingestivos, não foi afetada pelos diferentes tratamentos efetuados, pela região hipotalâmica examinada (ARC ou AHL) ou pelas diferentes fases do ciclo estral estudadas (estro e diestro). Estes resultados indicam que receptores 5-HT1A participam no controle serotoninérgico de mecanismos relacionados à regulação da ingestão de alimentos localizados no ARC e na AHL. Estes circuitos serotoninérgicos relacionados com ingestão de alimento em ambas as áreas são, possivelmente, afetados por hormônios esteróides ovarianos, que poderiam aumentar a sensibilidade dos neurônios do ARC aos efeitos hipofágicos desencadeados pela injeção de 8-OH-DPAT, ou aumentar a eficácia de sinais de saciedade que desencadeiam o término do consumo de alimento. Além disso, este estudo indica que circuitos serotoninérgicos localizados no ARC e na AHL não exercem uma atividade inibitória tônica sobre circuitos neuronais relacionados com a ingestão de alimento.

Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas. Programa de Pós-graduação em Neurociências / Made available in DSpace on 2013-07-16T01:50:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 213448.pdf: 826974 bytes, checksum: e222fad3b88d4e5225edb19effb026df (MD5) / No presente estudo, investigou-se a presença de receptores serotonérgicos no hipotálamo posterior medial (PMH) e no núcleo paraventricular (PVN) envolvidos no controle neural da ingestão de alimento e de água em pombos saciados (Columba livia). Para tanto, administrou-se nesses sítios hipotalâmicos a MET (um antagonista não-seletivo dos receptores 5-HT1/2), o GR 46611 (agonista dos receptores 5-HT1B/1D) e o 8-OH-DPAT (agonista 5-HT1A), a fim de identificar os subtipos de receptores presentes nesses locais. Foram utilizados animais saciados, com cânulas-guia implantadas próximas ao PMH e ao PVN, onde era inserida a agulha injetora excedendo em 1,0; 1,7; 2,4 ;3,1; e 3,8mm a cânula-guia. Uma semana após a cirurgia, as aves foram tratadas com veículo (ácido ascórbico 5%), MET (20 nmol), GR (0,6 e 6 nmol) ou 8OH (6 nmol), aleatoriamente. Após a administração das drogas, os animais retornavam às suas gaiolas, que continham água e alimento previamente pesados. O registro comportamental era efetuado durante 1 hora, onde era avaliado o comportamento ingestivo relativo ao consumo de alimento e água (duração e latência) e os comportamentos não ingestivos auto-limpeza, locomoção, parado alerta e posturas típicas de sono (duração e latência). Ao final de 1 hora, o consumo de alimento e de água foi quantificado. Os dados mostram que a injeção de MET no PMH provocou uma resposta hiperfágica, acompanhada de aumento na duração da refeição e redução na latência para iniciar o comportamento alimentar, comparado com os valores obtidos com a injeção de veículo. No PVN, a administração de MET provocou um aumento da quantidade de alimento ingerido, sem alterar a duração total e a latência para iniciar o comportamento ingestivo. O tratamento com GR 46611 no PMH resultou em uma resposta semelhante à obtida com a MET, em ambas as doses utilizadas, e de maneira dose-dependente, sendo mais eficaz a dose de 6 nmol. Entretanto, no PVN apenas a dose maior de GR obteve êxito em causar hiperfagia e aumento na magnitude da ingestão de alimento, sem interferir na latência para iniciar a resposta ingestiva. A administração de 8OH não modificou nenhum dos aspectos avaliados pertinentes à ingestão de alimento. O comportamento de ingestão de água foi modificado pela injeção de GR no PMH. Ambas as doses induziram uma resposta dipsogênica e provocaram uma redução na latência para iniciar a ingestão de alimento, mais eficazmente na dose de 0,6 nmol, mas somente a dose de 6 nmol retardou o término dessa resposta. O tratamento realizado com a MET não alterou a ingestão hídrica em nenhum dos sítios investigados. Porém, a administração de 8OH no PVN induziu um aumento significante na latência para iniciar o consumo de água. Os efeitos provocados pelas drogas administradas foram estritamente relacionados ao comportamento ingestivo, uma vez que não houve alterações nos comportamentos não ingestivos. Concluindo, o presente estudo indicou a presença dos receptores serotonérgicos 5-HT1B/1D no PMH e no PVN envolvidos com a regulação da ingestão de alimento e de água (a última somente no PMH) em pombos, interferindo nos processos de saciação e de saciedade.

Personalidade e temperamento têm sido frequentemente associados aos transtornos de ansiedade. Considerando a predisposição e vulnerabilidade, os traços de personalidade têm sido investigados como um possível fenótipo intermediário aos transtornos de ansiedade em estudos de genética. Pacientes com Transtorno de Pânico (TP) apresentam elevados escores em Evitação de Dano (ED), temperamento caracterizado por Cloninger como timidez e comportamento inibido para novos estímulos, e neuroticismo, quando comparados com indivíduos sem patologia psiquiátrica, mesmo na fase assintomática da doença. O polimorfismo da região promotora do gene transportador de serotonina (5HTTLPR) tem sido investigado em estudos de associação, evidenciando forte correlação com neuroticismo. Recentemente, evidenciou-se que a forma longa do polimorfismo 5HTTLPR possui uma variação gênica (Lg) que está ligada à diminuição de sua expressividade. O presente trabalho teve como objetivo investigar a associação entre o temperamento, a personalidade e os fatores genéticos no TP.Na primeira etapa deste estudo participaram 135 pacientes com TP emparelhados por sexo e idade com 135 controles sem transtorno psiquiátrico avaliados através do M.I.N.I. (Mini International Neuropsychiatric Interview – Brazilian version 5.0.0 – DSM IV) – uma entrevista estruturada que avalia de modo padronizado os principais transtornos psiquiátricos do Eixo I, de acordo com os critérios do DSM-IV. Para avaliação da personalidade foi utilizado o Temperament and Character Inventory (TCI). Uma sub-amostra deste estudo (n=67) também foi avaliada através do Minnesota Multiphasic Personality VI Inventory (MMPI). Pacientes com TP apresentaram maiores escores na escala de temperamento ED e menores escores nas escalas de caráter Auto Direcionamento (AD) e Cooperatividade (C) quando comparado ao grupo controle. Uma correlação positiva entre o temperamento de ED do TCI e as escalas da tríade neurótica (Histeria, Depressão, Hipocondria) do MMPI foi encontrada, sugerindo que esses constructos se referem, ao menos em parte, a características de personalidade intercambiáveis. Em uma segunda etapa, este estudo avaliou a associação entre o polimorfismo 5-HTTLPR no sistema trialélico e traços de personalidade neuróticos (tríade neurótica Hs, D, Hy - MMPI) em 67 pacientes caucasóides com TP em remissão. O critério de remissão para este estudo foi CGI (Clinical Global Impression) ≤ 2 e ausência de ataques de pânico. A personalidade foi avaliada através do MMPI, com a classificação dos escores em patológico (≥ 70), alto (de 55 à 69) e normal ou baixo (≤ 54). Os genótipos dos pacientes foram agrupados pelo nível de expressividade: Baixa Expressividade (SS, SLg e LgLg), Expressividade Intermediária (SLa, LgLa) e Alta Expressividade (LaLa). Não houve desvio significativo do equilíbrio de Hardy Weinberg (χ²=0.52, df=1, p=0.471). De acordo com a classificação trialélica, a distribuição dos alelos nestes pacientes foi: S 58 (43.3%), Lg 17 (12.7%) e La 59 (44.0%). Não houve diferenças significativas nas escalas do MMPI entre as diferentes classificações dos genótipos e nas análises dos alelos nesse estudo. Esse estudo conta com algumas limitações, entretanto, representa um dos primeiros estudos de genética a investigar a associação do polimorfismo 5HTTPLR e traços de personalidade em pacientes com TP em uma amostra brasileira. No futuro, amostras maiores serão necessárias para excluir influências menores do gene nesses traços, assim como outros polimorfismos e a utilização de outros constructos deverão ser considerados na caracterização de um fenótipo herdável no TP.

Personalidade e temperamento têm sido frequentemente associados aos transtornos de ansiedade. Considerando a predisposição e vulnerabilidade, os traços de personalidade têm sido investigados como um possível fenótipo intermediário aos transtornos de ansiedade em estudos de genética. Pacientes com Transtorno de Pânico (TP) apresentam elevados escores em Evitação de Dano (ED), temperamento caracterizado por Cloninger como timidez e comportamento inibido para novos estímulos, e neuroticismo, quando comparados com indivíduos sem patologia psiquiátrica, mesmo na fase assintomática da doença. O polimorfismo da região promotora do gene transportador de serotonina (5HTTLPR) tem sido investigado em estudos de associação, evidenciando forte correlação com neuroticismo. Recentemente, evidenciou-se que a forma longa do polimorfismo 5HTTLPR possui uma variação gênica (Lg) que está ligada à diminuição de sua expressividade. O presente trabalho teve como objetivo investigar a associação entre o temperamento, a personalidade e os fatores genéticos no TP.Na primeira etapa deste estudo participaram 135 pacientes com TP emparelhados por sexo e idade com 135 controles sem transtorno psiquiátrico avaliados através do M.I.N.I. (Mini International Neuropsychiatric Interview – Brazilian version 5.0.0 – DSM IV) – uma entrevista estruturada que avalia de modo padronizado os principais transtornos psiquiátricos do Eixo I, de acordo com os critérios do DSM-IV. Para avaliação da personalidade foi utilizado o Temperament and Character Inventory (TCI). Uma sub-amostra deste estudo (n=67) também foi avaliada através do Minnesota Multiphasic Personality VI Inventory (MMPI). Pacientes com TP apresentaram maiores escores na escala de temperamento ED e menores escores nas escalas de caráter Auto Direcionamento (AD) e Cooperatividade (C) quando comparado ao grupo controle. Uma correlação positiva entre o temperamento de ED do TCI e as escalas da tríade neurótica (Histeria, Depressão, Hipocondria) do MMPI foi encontrada, sugerindo que esses constructos se referem, ao menos em parte, a características de personalidade intercambiáveis. Em uma segunda etapa, este estudo avaliou a associação entre o polimorfismo 5-HTTLPR no sistema trialélico e traços de personalidade neuróticos (tríade neurótica Hs, D, Hy - MMPI) em 67 pacientes caucasóides com TP em remissão. O critério de remissão para este estudo foi CGI (Clinical Global Impression) ≤ 2 e ausência de ataques de pânico. A personalidade foi avaliada através do MMPI, com a classificação dos escores em patológico (≥ 70), alto (de 55 à 69) e normal ou baixo (≤ 54). Os genótipos dos pacientes foram agrupados pelo nível de expressividade: Baixa Expressividade (SS, SLg e LgLg), Expressividade Intermediária (SLa, LgLa) e Alta Expressividade (LaLa). Não houve desvio significativo do equilíbrio de Hardy Weinberg (χ²=0.52, df=1, p=0.471). De acordo com a classificação trialélica, a distribuição dos alelos nestes pacientes foi: S 58 (43.3%), Lg 17 (12.7%) e La 59 (44.0%). Não houve diferenças significativas nas escalas do MMPI entre as diferentes classificações dos genótipos e nas análises dos alelos nesse estudo. Esse estudo conta com algumas limitações, entretanto, representa um dos primeiros estudos de genética a investigar a associação do polimorfismo 5HTTPLR e traços de personalidade em pacientes com TP em uma amostra brasileira. No futuro, amostras maiores serão necessárias para excluir influências menores do gene nesses traços, assim como outros polimorfismos e a utilização de outros constructos deverão ser considerados na caracterização de um fenótipo herdável no TP.

Doctor en Farmacología / Autorizada por el autor, pero con restricción para ser publicada a texto completo en el Portal de tesis, hasta enero de 2017 / La Serotonina (5-HT) es un neurotransmisor detectado tempranamente durante el desarrollo del sistema nervioso central y recientemente se ha descrito su papel sobre los procesos de migración y morfología neuronal. Mediante la inhibición farmacológica de la síntesis de 5-HT durante el desarrollo embrionario, se ha determinado que la reducción en este neurotransmisor produce efectos a largo plazo reflejado en una disminución del peso del cerebro, alteración en la maduración neuronal y una disminución de la complejidad dendrítica. La 5-HT ejerce sus acciones a través de sus receptores ionotrópicos (5HT3) y metabotrópicos (5HT1, 5HT2, 5HT4-5HT7). Algunos de ellos se expresan tempranamente durante el desarrollo embrionario y más aún puede variar su distribución y/o niveles en forma dinámica durante el desarrollo pre y posnatal. Para efectos de esta Tesis se destacan los receptores 5HT1A y 5HT7 los cuales están presentes en estructuras cerebrales como el hipocampo. Interesantemente, el 5HT1A-R se expresa tempranamente durante el desarrollo embrionario; por lo cual se postula que la 5-HT tendría un efecto modulador sobre la migración, diferenciación y viabilidad celular. En cambio, solo se ha descrito una expresión dinámica del 5HT7-R durante el desarrollo posnatal; lo que sugiere una acción de este receptor en estadíos bien definidos. La sobre-expresión de los receptores serotoninérgicos 5HT1A y 5HT7 en líneas celulares, ha permitido estudiar su acoplamiento a distintas cascadas transduccionales. Se ha descrito el acoplamiento a diversas proteínas G que permiten la activación o inhibición de proteínas efectoras como AC, fosfolipasas, regulación de canales iónicos y activación de las vías MAPK y PI3K-Akt, entre otras. Estas vías participan promoviendo la formación de neuritas y dendritas y han sido involucradas con la regulación de la plasticidad sináptica. En contraste, los efectores de estos receptores descritos en líneas celulares no han sido bien definidos en neuronas. Si bien existen algunos antecedentes que apoyan la idea de que la 5-HT regula la morfología neuronal, no se ha establecido la participación de un subtipo de receptor en particular. La activación del 5HT1A-R induce un aumento en el número y largo de neuritas en neuroblastoma de ratón. En relación a estos cambios morfológicos, se ha descrito que la vía de las Rho GTPasas regula el citoesqueleto a través de la modulación de la cofilina, importante regulador del citoesqueleto de actina. Se ha demostrado un acoplamiento entre el 5HT7-R y Gα12 y el aumento del crecimiento de neuritas en neuronas hipocampales, aunque no se ha dilucidado cuáles son sus efectores río abajo. De acuerdo a estos antecedentes se postuló la siguiente hipótesis: “Agonistas de los receptores 5HT1A y 5HT7 activan vías transduccionales que modulan el citoesqueleto, efectos que se asocian a cambios morfológicos de neuronas hipocampales en cultivos”. Los objetivos fueron: 1) Determinar en neuronas hipocampales con distinta madurez, el efecto de agonistas de los receptores serotoninérgicos 5HT1A y 5HT7 sobre proteínas que participan en vías transduccionales, que tienen como blanco el citoesqueleto de microtúbulos y de actina, como Akt-GSK-3β, ERK y cofilina, respectivamente. 2) Determinar el efecto de agonistas de los receptores serotoninérgicos 5HT1A y 5HT7 sobre la morfología de neuronas hipocampales con distinta madurez. Estos objetivos se desarrollaron utilizando antagonistas específicos para los receptores 5HT1A (WAY-100635) y 5HT7 (SB269970). En esta tesis se demostró que la distribución del receptor 5HT1A experimenta una polarización a mayor madurez del cultivo, encontrándose tempranamente en el soma y más tardíamente con una localización somato-dendrítica, sin variar el nivel del receptor. En contraste, la distribución somato-dendrítica del 5HT7-R fue independiente de la madurez del cultivo. A su vez, se detectaron las isoformas 5HT7a-R y 5HT7b-R y cuya relación no varió durante los días del cultivo in vitro (DIV). No obstante, ambas isoformas aumentan significativamente entre los 2 y 14 DIV. El 8OH-DPAT, agonista de los receptores 5HT1A (Ki 10 nM) y 5HT7 (Ki 52 nM), promueve la activación de la vía Akt-GSK-3β a los 2 DIV, efecto que involucraría la participación del 5HT7-R y, probablemente al 5HT1A-R. Adicionalmente, el 8OH-DPAT en neuronas más maduras (7 DIV), aumentó la activación de la Akt, efecto independiente de los receptores 5HT1A y 5HT7. Estos resultados sugieren que este agonista puede activar a otros receptores, lo que plantea una reevaluación de su acción como agonista selectivo del 5HT1A. Por otra parte, a pesar de la activación de la Akt, no se observaron cambios en la fosforilación de la GSK-3β, sugiriendo una disociación de ambas quinasas a este estadío. Adicionalmente, el 8OH-DPAT ó la 5-HT no modificaron significativamente el estado de fosforilación de las ERK1/2. La estimulación durante 24 horas con 8OH-DPAT en neuronas con 2 DIV aumentó significativamente el número de las neuritas primarias, acompañado de un aumento en el largo neurítico total; efectos no asociados a los receptores 5HT1A y 5HT7. Estos resultados sugieren que el 8OH-DPAT activa un receptor que incrementa el número de neuritas sin afectar su largo. Interesantemente, se observó que la estimulación con 8OH-DPAT disminuyó significativamente la fosforilación inactivante de la cofilina en Ser3; efecto insensible a la acción de los antagonistas de los receptores 5HT1A y 5HT7. Similarmente, a los 7 DIV se observó una disminución significativa de los niveles fosforilados de cofilina luego de la estimulación con 5-HT, efecto no asociado a los receptores 5HT1A y 5HT7, sugiriendo la participación de un receptor serotoninérgico desconocido sobre la dinámica de actina. Adicionalmente, la activación del 5HT7-R con 8OH-DPAT y 5HT a los 2 DIV durante 24 h disminuye el número de las dendritas primarias pero promueve el crecimiento. A este mismo estadío neuronal, la 5-HT a través de 5HT1A-R y 5HT7-R aumentó el crecimiento de dendritas secundarias. Por otro lado, se demostró a los 8 DIV que la 5-HT aumenta el número de dendritas primarias más cortas a través de un receptor serotoninérgico desconocido. Adicionalmente, los cambios inducidos por la 5-HT a los 8 DIV, indican que el 5HT1A-R promueve una reducción en el largo de las dendritas primarias, fenómeno observado por la reducción en el número de las dendritas primarias más largas (> 40 μm); efecto también observado en las secundarias más largas (> 20 μm). En apoyo, el análisis de Sholl muestra una disminución de la complejidad neuronal asociada a este receptor. Es decir, el 5HT1A-R inhibe el crecimiento y la complejidad dendrítica, probablemente al frenar el crecimiento o elongación de éstas, quedando por establecer los mecanismos moleculares asociados. En apoyo a este hallazgo, se ha descrito recientemente en hipocampo de ratón adulto que el 5HT1A-R produce una disminución de las dendritas terciarias. En contraste, a los 8 DIV el 5HT7-R promueve un aumento del crecimiento de dendritas primarias y secundarias, siendo este último efecto también observado por la estimulación del 5HT1A-R. En resumen, el 5HT1A-R promueve una disminución de la complejidad dendrítica, en contraste al efecto positivo de la activación del 5HT7-R observado a nivel de las neuritas y dendritas; sugiriendo que estos receptores pueden modular la morfología neuronal de forma diferencial dependiendo de la madurez del cultivo. Además, por primera vez se involucra la participación de los receptores 5HT1A y 5HT7 sobre la morfología neuronal en cultivo primario de hipocampo de rata. Además, este estudio muestra los efectos de agonistas serotoninérgicos sobre vías transduccionales relacionadas a la modulación del citoesqueleto y cambios en la morfología que depende de la madurez de neuronas hipocampales. / Serotonin (5-HT) is a neurotransmitter found early during development of the central nervous system and recently it has been involved in cell migration and neuronal morphology. The pharmacological inhibition of 5-HT synthesis during embryonic development suggests that its reduction produces long-term effects reflected as decreased brain weight, altered neuronal maturation and reduction of dendritic complexity. The 5-HT exerts its actions through ionotropic (5HT3) and metabotropic (5HT1, 5HT2, 5HT4-5HT7) receptors. Some of these receptors are expressed early during embryonic development and their distribution or levels can change dynamically during pre-and postnatal development. This thesis focuses on 5HT1A and 5HT7 receptors, which are present in brain structures such as the hippocampus. Interestingly, the 5HT1A-R is expressed early during embryonic development, suggesting that 5-HT could have a modulating effect on cell migration, differentiation and viability. In contrast, a dynamics expression of 5HT7-R has been described during postnatal development, suggesting a role in well-defined neuronal stages. Overexpression of 5HT1A and 5HT7 serotonin receptors in cell lines has allowed studying their coupling to several transduction pathways. These receptors are coupled to several G protein allowing the activation or inhibition of effector proteins such as AC, phospholipases, regulation of ion channels and activation of MAPK and PI3K-Akt, among others. These pathways promote neurites and dendrites formation, and have been implicated in the regulation of synaptic plasticity. In contrast, the effectors of these receptors described in cell lines have not been well defined in neurons. Although some evidences support the idea that 5-HT regulates neuronal morphology, it has not been established which serotonergic receptors are involved. The 5HT1A-R activation induces an increase in both the number and length of neurites in mouse neuroblastoma. In relation to these morphological changes, it has been described that Rho GTPases pathway regulates the cytoskeleton through the modulation of cofilin, an important regulator of actin dynamics. Additionally, a link between 5HT7-R, activation of Gα12 and the increase of neurite outgrowth in hippocampal neurons has been described, but it has not been elucidated the transduction pathway involved. According to these evidences, the following hypothesis was proposed: “Agonists of 5HT1A and 5HT7 receptors activate pathways that modulate the cytoskeleton, effects that are associated with morphological changes in cultured hippocampal neurons." The aims were to: 1) Determine, the effect of 5HT1A-R and 5HT7-R agonist on proteins involved in transduction pathways, targeting microtubule and actin cytoskeleton like Akt-GSK- 3β, ERK and cofilin, respectively, on hippocampal neurons with different maturity. 2) Determine the effect of 5HT1A-R and 5HT7-R agonist on morphology of hippocampal neurons with different maturity. These objectives were developed using specific antagonists of 5HT1A (WAY-100635) and 5HT7 (SB269970) receptors. In this thesis it was shown that the distribution of 5HT1A receptor undergoes a polarization during the maturity of neurons, being early found in the soma and late with a somato-dendritic distribution but without changes on receptor levels. In contrast, the somato-dendritic distribution of 5HT7-R was independent of neuronal maturity. Besides, the isoforms “a” and “b” of 5HT7-R were detected without changes in their ratio during days in vitro (DIV). Nonetheless, both isoforms increased significantly from 2 to 14 DIV. The 8OH-DPAT, a 5HT1A (Ki 10 nM) and 5HT7 (Ki 52 nM) receptor agonist, promotes the activation of the Akt-GSK-3β pathway at 2 DIV, effect which involves the participation of 5HT7-R and probably the 5HT1A-R. Additionally, in more mature neurons (7 DIV) stimulation with 8OH-DPAT increased activation of Akt, an effect independent of 5HT1A and 5HT7 receptors. These results suggest that this agonist may activate other receptors, and hence demands a reconsideration of its action as selective 5HT1A agonist. Moreover, in spite of Akt activation, no changes were observed in the phosphorylation levels of GSK-3β, suggesting dissociation of both kinases at this stage. Additionally, neither 8OH-DPAT nor 5-HT altered the phosphorylation levels of ERK1/2. Stimulation for 24 hours with 8OH-DPAT at 2 DIV significantly increased the number of primary neurites, accompanied by an increase in the overall length of neurites; effects which are not related to 5HT1A and 5HT7 receptors. These evidences suggest that 8OH-DPAT targets an unknown receptor whose activation increases the number of neurites without affecting their length. Interestingly, it was observed that stimulation with 8OH-DPAT significantly decreased the inactivating phosphorylation of cofilin in Ser3; an effect insensitive to the antagonists of the 5HT1A and 5HT7 receptors. Similarly, a significant decrease of phosphorylated cofilin levels after stimulation with 5-HT was observed at 7 DIV; effect not associated to 5HT1A and 5HT7 receptors, suggesting the participation of an unknown serotonin receptor modulating actin dynamics. Additionally, the 5HT7-R activation with 8OH-DPAT and 5-HT at 2 DIV during 24 h decreases the number of primary dendrites but promotes its growth. At this neuronal stage, 5-HT stimulates secondary dendrite growth through both 5HT1A-R and 5HT7-R. Furthermore, this thesis demonstrated at 8 DIV that 5-HT increases the number of short primary dendrites via an unknown serotonergic receptor. Additionally, the changes induced by 5-HT at 8 DIV, indicate that 5HT1A-R promotes a reduction in the length of the primary dendrites, a phenomenon observed as reduction in the number of longer primary dendrites (> 40 um); effect also observed in longer secondary dendrites (> 20 um). In accordance, Sholl analysis shows a decrease in neuronal complexity associated with this receptor. Thus, 5HT1A-R inhibits primary dendritic growth and complexity, probably by slowing the growth or elongation, and the molecular mechanisms associated remains to be explained. In support of this finding, it has been recently described in adult mouse hippocampus, that 5HT1A-R promotes a decrease of tertiary dendrites. In contrast, this Thesis described that 5HT7-R induces an increased growth of primary and secondary dendrites at 8 DIV; being the latter effect also observed by 5HT1A-R stimulation. To summarize, the 5HT1A promotes a reduction of dendritic complexity in contrast to the positive effect of 5HT7 receptors observed in both neurites and dendrites; suggesting that these receptors differentially modulate the neuronal morphology depending on neuron maturity. Furthermore, we described for first time the participation of 5HT1A and 5HT7 on neuronal morphology in primary culture of rat hippocampal neurons. Additionally this study shows the effects of serotonergic agonists on transduction pathways related to cytoskeleton modulation and morphological changes depending on maturity of hippocampal neurons. / Conicyt

Resumo não disponível

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A serotonina está presente no Sistema Nervoso Central (SNC), gânglios perifé-ricos, e órgãos neuroendócrinos de crustáceos, participando de muitos processos fisi-ológicos. Receptores serotoninérgicos com perfil farmacológico similar ao dos recep-tores 5-HT1 e 5-HT2 de vertebrados já foram identificados em crustáceos, assim como os efeitos de vários agonistas e antagonistas destes receptores. O objetivo geral deste trabalho foi investigar a localização dos receptores serotoninérgicos nos tecidos-alvo periféricos do caranguejo Neohelice granulata pela técnica de binding, utilizando serotonina triciada (5-HT-H3), identificar o perfil fisiológico e farmacológico dos receptores pela técnica de binding, utilizando metiotepina, antagonista dos receptores serotoninérgicos 5-HT1 e ciproeptadina, antagonista dos receptores serotoninérgicos 5-HT2 e verificar o efeito dos antagonistas sobre o metabolismo de carboidratos e a postura de caranguejos N. granulata. Os experimentos in vivo e in vitro, foram realizados com grupos de animais alimentados com dieta rica em proteínas (RP), rica em carboidratos (RC) e animais do campo. O presente trabalho mostra que fatores nutricionais relacionados às dietas ofe-recidas aos caranguejos interagem com a serotonina, controlando a homeostase da glicose. Resultados obtidos com a administração dos antagonistas metiotepina e ci-proeptadina sugerem que os receptores serotoninérgicos envolvidos no controle do metabolismo de carboidratos possam ter um mecanismo de ação similar aos recepto-res 5-HT2 de mamíferos. A administração de serotonina e ciproeptadina nos animais promoveu uma for-te flexão de membros e abdome. No entanto, a administração de metiotepina promo-veu um relaxamento da musculatura, sugerindo a existência de receptores com perfil farmacológico similar aos receptores 5-HT1 de mamíferos no sistema nervoso periférico. Não foram encontradas terminações nervosas próximas ou se inserindo nas lamelas branquiais, e também não se observou qualquer neurônio imunorreativo à serotonina em ambas as brânquias, sugerindo que a serotonina seja liberada de ór-gãos neuroendócrinos para a hemolinfa do N. granulata, e tenha sua ação como neu-ro-hormônio nas brânquias. Foram localizados receptores serotoninérgicos no caranguejo N.granulata através da ligação específica de serotonina triciada (5-HT-H3) nas brânquias posteriores, maior ligação entre todos, brânquias anteriores, coração, hepatopâncreas e músculo mandibular. Experimentos in vivo mostraram no músculo, hepatopâncreas e coração, que a administração de 5-HT juntamente com 5-HT-H3 promove redução da ligação em seus receptores em animais do campo, demonstrando a especificidade da ligação. Nos animais em dieta RC ou RP a ligação não foi alterada, sugerindo um possível efeito da dieta sobre a ligação de 5-HT-H3. Resultados da administração dos antagonistas no músculo, em conjunto com os obtidos na reação postural, reforçam a hipótese da presença de receptores com perfil farmacológico similar aos 5HT1 de mamíferos neste tecido. No hepatopâncreas e coração, a administração dos antagonistas sugerem a presença de receptores com perfil farmacológico distinto dos receptores 5-HT1 e 5-HT2. Em ambas as brânquias, observou-se que a ligação de 5-HT-H3 é alterada em função do tempo de injeção e apresentam alta ligação de 5-HT-H3. Nos animais da dieta RP a administração de 5-HT reduziu a ligação de 5-HT-H3 em ambas as brânquias, confirmando a especificidade da ligação e a dopamina reduziu a ligação de 5-HT-H3 nas brânquias anteriores. Com a administração dos antagonistas, sugere-se a existência de receptores serotoninérgicos nas brânquias com perfil farmacológico similar aos receptores 5-HT1 de mamíferos. Nos animais alimentados com dieta RC e do campo, não foram observadas alterações na ligação de 5-HT-H3 com o uso de 5-HT, dopamina e antagonistas em ambas as brânquias, mostrando novamente que a dieta pode estar interferindo na ligação de 5-HT-H3. Em estudos in vitro realizados em ambas as brânquias, as curvas de competi-ção entre 5-HT-H3 e serotonina em caranguejos alimentados com ambas as dietas, mostram que a serotonina inibe a ligação de 5-HT-H3 de forma dose-dependente, de-monstrando a especificidade da ligação. A metiotepina e ciproeptadina não inibiram a ligação de 5-HT-H3 de forma dose-dependente, mas observa-se uma diminuição de aproximadamente 50% na ligação em ambas as brânquias de animais alimentados com dieta RP, evidenciando a existência de receptores do tipo 5-HT1 e 5-HT2 nestes tecidos. O presente trabalho propõe a existência de receptores serotoninérgicos nas brânquias posteriores e anteriores, coração, hepatopâncreas e músculo mandibular do caranguejo N. granulata e que a dieta oferecida aos animais interfere na ligação da serotonina em seus receptores nestes tecidos-alvo periféricos. Existem provavelmen-te três tipos de receptores serotoninérgicos nos tecidos-alvo periféricos do caranguejo N. granulata: um receptor 5-HT1Neo com perfil similar ao receptor 5-HT1 de mamífero; um receptor 5-HT2Neo com perfil similar ao receptor 5-HT2 e provavelmente, um tercei-ro, o 5-HT-H3Neo com perfil farmacológico indeterminado.