INTRODUÇÃO:A neuraminidase 1 (chamada a seguir por Neu1) regula o catabolismo de sialoglicoconjugados nos lisossomos. A deficiência congênita da Neu1 é a base da sialidose, doença neurossomática grave associada a deformidades osteoesqueléticas, hipotonia e fraqueza muscular. Camundongos com deficiência de Neu1 desenvolvem uma forma atípica de degeneração muscular caracterizada porproliferação anormal de fibroblastoslevando a invasão nas fibras musculares, expansão da matriz extracelular (MEC), fragmentação do citoplasma, formação vacuolar e atrofia muscular. A ocorrência de atrofia muscular indica que a deficiência da Neu1 podeestar relacionada com o controle da massa muscular, a qual é dependente do equilíbrio entre síntese e degradação proteica.Uma característica principalnaMacroautofagia (denominada a seguir por autofagia) é a principal via de degradação intracelular sendo expressamente essencial para a homeostase celular e remoção de materiais citoplasmáticos. Objetivos: Avaliarseos efeitos da deficiência da Neuraminidase 1 afetama indução de autofagia e a formação de autofagossomos e determinar os efeitos do bloqueio da função lisossomal sobre o fenótipo muscular na deficiência da Neuraminidase1.Metodologia:Camundongos Neu1+/-foram cruzados e os filhotes genotipados, onde camundongos Neu1-/-(nocaute) e Neu1+/+(normal),foram utilizados no estudon total=90, sendo 10 em padronizações, 20 para coleta de fibroblastos e 60 para procedimentos in vivo, os grupos experimentais foram divididos em privação alimentar por 2 dias que, por meio da inibição do mTOR, induz a autofagia;grupo detratamento com Colchicina por 4 dias onde irá impedir a junção autofagossomo/lisossomonão havendo a degradaçãolisossomaleadicionado nos dois últimos dias de privação alimentar e o grupo de tratamento comRapamicina por 7 dias, droga com função de inibir seletivamente o mTOR.Após os tratamentos, os animais foram eutanasiadospara coleta dos músculos gastrocnêmios e tibiais anterior. Os músculos foram analisados apósas coloraçõeshistológicas porHematoxilina & Eosina e Fosfatase Ácida; Imunofluorescência de LC3-I/II; Western Blottingdas proteínas LC3-I/II, Lamp-1 e p62/SQSTM e a análise Ultra-estrutural. Além disso, foi realizada cultura de fibroblastos, os quais foram submetidos à privação de nutrientes e ao tratamento com Rapamicina, seguidos dasmesmas metodologias de análise invivo. Resultados:As análises histológicas através de H&E e Fosfatase Ácida não revelaram alterações consistentes na musculatura esquelética de animais submetidos aos tratamentos, mostrando em animais com deficiência de Neu1 um aumento anormal do espaço endomisial, e aumento da atividade lisossomalintracitoplasmáticos. Na análise ultra-estruturalobservou-se em todos os grupos, a presença de diversas estruturas com aspecto autofágico, de diferentes tamanhos, formas e constituintes. Naanálise da expressão do LC3 através de Western Blottingmostrou importante ativação do LC3-II na privação alimentar (com e sem administração de Colchicina) tanto em animais controles quanto em animais com deficiência de Neu1 e uma importante ativação do LC3-I em Rapamicina em ambos os grupos mostrando assim que houve um aumento da via da autofagia através do bloqueio do mTOR. Já na análise de Imunofluorescência não foi possível observar diferença consistenteentre os grupos.A análise in vitrode Western Blottingmostrou que tal ativação foi similar entre fibroblastos Neu1+/+e Neu1-/-. Conclusão:Os experimentos relacionados com a ativação ou inibição da autofagia, não resultaram em diferenças consideráveis entre músculos normais e músculos com deficiência de Neu1. Desta forma, podemos concluir com estes experimentos que aparentemente a Neu1, apesar de ser uma importante enzima lisossomal, não interfere com o processo de autofagia / Introduction:Neuraminidase 1 (hereinafter Neu1) regulates the catabolism of sialoglycoconjugates in lysosomes. The congenital deficiency of Neu1 is the basis of sialidosis, a severe neurosomatic disease associated with osteo-skeletal deformities, hypotonia, and muscle weakness. Mice with Neu1deficient develop an atypical form of muscle degeneration characterized by abnormal fibroblast proliferation leading to muscle fiber invasion, extracellular matrix expansion (ECM), cytoplasm fragmentation, vacuolar formation, and muscle atrophy. The occurrence of muscle atrophy indicates that deficiencyofNeu1 may be related to the control of muscle mass, which is dependent on the balance between synthesis and protein degradation. A major feature in Macroautophagy (hereinafter referred to as autophagy) is the main pathway of intracellular degradation being expressly essential for cellular homeostasis and removal of cytoplasmic materials. Objectives:To evaluate whether the effects of neuraminidase 1 deficiency affect autophagy induction and autophagosome formation and to determine the effects of lysosomal function block on muscle phenotype in neuraminidase 1 deficiency. Methodos:Mice Neu1+/-were crossbred and the genotyped pups, where mice Neu1-/-(knockout) and Neu1+/+(normal), were used in the study ntotal = 90, 10 for standardization, 20 for fibroblast collection and 60 for in vivo procedures, experimental groups were divided into food deprivation for 2 days that, through mTOR inhibition, induces autophagy; Colchicine treatment group for 4 days whereit will prevent autophagosome/lysosome junction without lysosomal degradation and added in the last two days of food deprivation and Rapamycin treatment group for 7 days, drug with function to selectively inhibit mTOR. After the treatments, the animals were euthanized to collect the anterior gastrocnemius and tibial muscles. The muscles were analyzed after histological staining by Hematoxylin & Eosin and Acid Phosphatase; LC3-I/II immunofluorescence; Western Blottingof LC3-I/II, Lamp-1 and p62/SQSTM proteins and Ultra-structural analysis. In addition, fibroblasts were cultured and subjected to nutrient deprivation and Rapamycin treatment, followed by the same in vivo analysis methodologies. Results:Histological analyzes by H&E and Acid Phosphatase did notreveal consistent changes in skeletal muscle of animals submitted to treatments, showing in animals with Neu1 deficiency an abnormal increase in endomysial space and increased intracytoplasmic lysosomal activity.In ultrastructural analysis, it was observed in all groups, the presence of several structures with autophagic aspect, of different sizes, shapes and constituents. The analysis of LC3 expression by Western Blottingshowed important activation of LC3-II in food deprivation (with and without Colchicine administration) in both control and Neu1 deficient animals and an important activation of LC3-I in Rapamycininboth groups,thus showing an increase in the autophagy pathway through mTOR blockade. In the immunofluorescence analysis, it was not possible to observe consistent difference between the groups. In vitro Western Blottinganalysis showed that such activation was similar between Neu1+/+and Neu1-/-fibroblasts. Conclusion: Experiments related to activation or inhibition of autophagy did not result in considerable differencesbetween normal muscles and Neu1 deficient muscles. Thus, we can conclude from these experiments that apparently Neu1, despite being an important lysosomal enzyme, does not interfere with the autophagy process
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-03102019-110525 |
| Date | 18 July 2019 |
| Creators | Larina Neto, Rubens de |
| Contributors | Zanoteli, Edmar |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | Dissertação de Mestrado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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