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Previous issue date: 2014-10-07 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto de Pesquisa Clínica Evandro Chagas, Rio de Janeiro, RJ, Brasil / A histoplasmose é uma infecção que apresenta amplo espectro clínico, variando desde forma leves, a graves e disseminadas. O diagnóstico da histoplasmose baseia-se nos aspectos clínicos, radiológicos e epidemiológicos. A confirmação se dá pelo isolamento e identificação do Histoplasma capsulatum através de procedimentos microbiológicos. Diferentes metodologias já foram descritas no diagnóstico sorológico da histoplasmose, porém limitações relacionadas a reações cruzadas e limiar de detecção das técnicas empregadas podem dificultar o diagnóstico. O antígeno M obtido do extrato antigênico histoplasmina é considerado um antígeno imunodominante para produção de anticorpos, sendo reconhecido em cerca de 90% dos soros dos pacientes com histoplasmose, sendo assim nosso grupo vem trabalhando a vários anos em estudos para um melhor conhecimento desta molécula e aplicação no diagnóstico.Um Modelo molecular do antigeno M foi desenvolvido através de sua sequência, tendo então confirmada sua natureza biológica como catalase, sendo observado também que esta molécula apresentava regiões comuns bem como especificas quando comparadas a catalases de organismos eucariotas. No presente estudo procuramos determinar a presença de possíveis epitopos antigênicos na proteína M empregando ferramentas proteômicas, para posterior emprego em ensaios imunoenzimáticos. Para tal foi utilizada a combinação da técnica de coimunoprecipitação com espectometria de massas e posteriormente a técnica de Spot synthesis
Com o emprego do anticorpo monoclonal (mAb 1A7) produzido contra a proteína M recombinante foi possível detectar uma sequência que foi comum as duas metodologias empregadas (PTKIIPEELVPFTP). Esta sequência encontra-se localizada na região onde em estudos anteriores por análise in silico foi apontada como a região mais antigênica desta molécula. Foi realizada a síntese desta sequência, e diferentes desenhos foram utilizados, extensão de resíduos de lisina e adição da molécula de biotina em ambas as extremidades, carboxi e amino terminal, bem como a síntese da sequência sem adição de outras moléculas. Diferentes desenhos de ensaios imunoenzimáticos foram realizados, um ELISA empregando microesferas carboxiladas, ELISA indireto empregando placas de microtitulação revestidas com estreptoavidina e um ELISA sandwich. A sequência não apresentou resultados satisfatórios nos diferentes ensaios. Observamos que apenas no ensaio onde utilizamos o peptídeo ligado a molécula de biotina 1-a e 1-b, foi possível obter um poder discriminatório entre o grupos de pacientes com histoplasmose e o grupos de indivíduos hígidos, o ponto de corte foi obtido pela media das DOs das amostras de indivíduos hígidos mais duas vezes o desvio padrão, onde este teste apresentou uma boa sensibilidade(100 - 95%), porém a especificidade encontrada não foi satisfatória (27 - 20%). Estes resultados não foram concordantes com a análise feita in silico da sequência sintetizada. O antígeno M recombinante foi testado em um ELISA de captura de antígeno, onde os resultados preliminares apresentaram-se promissores necessitando de novos testes para avaliarmos parâmetros como sensibilidade e especificidade / Histoplasmosis is a worldwide distribution infection with
several clinical spectrum,
from
as
ymptomatic to severe
and disseminated disease
.
The diagnosis
of histoplasmosis
is based on
clinical, radiological
and epidemiological findings. The laboratory diagnosis of histoplasmosis is
based on fungus isolation by culture, direct examination in tissue
or other clinical specimens.
However, such procedures
have limitations and are time
-
consuming
. For these reasons
serological
tests play an important role
on
presumptive diagnosis
. Although
different
methodologies
have been described
for serological diagno
sis
of histoplasmosis
,
cross
-
reactions
and
low sensitivity could difficult the final result. The M antigen is obtain by the antigenic
extract histoplasmin and is considered as an immunodominant antigen recognized by 90% of
sera from patients with histoplas
mosis,
For a better understanding of the molecule biological
nature and its application in diagnosis methodologies our group has been working for several
years.
The molecular analysis of the M antigen was based on the sequence protein and confirmed
as a ca
talase. It was also observed that this molecule showed specific and common polypeptide
regions when compared to catalases from others eukaryotic organisms.
In this study we
evaluated the possible presence of antigenic epitopes in the M protein sequence tha
t could
represent potential candidate as diagnostic markers for histoplasmosis. For this reason we used
the combining co
-
immunoprecipitations and mass spectrometry and spot synthesis technique.
The application of a monoclonal antibody against to the M anti
gen (mAb 1A7) produced by our
group allowed the detection of a same sequence in both employed methodologies
(
PTKIIPEELVPFTP)
. This was synthesized with different conformations, addition lysine
residues and biotin molecules in both amino and carboxy term
inal regions. Different
immunoassays were performed, carboxylated microspheres, ELISA indireta with microplate
coated with
streptoavidin
and ELISA
sandwich
. The sequence did not show good specificity and
sensibility in different tests. A good discriminator
y power was possible when the peptide biotin
molecule bind (P1
-
a and P1
-
b) was used in serum samples from groups of histoplasmosis
patients and healthy controls.
This test showed a high sensitivity (100
-
95%), however the
specificity was not satisfactory (
27
-
20%) respectevily. The ELISA ́s cut
-
off points were
established as the mean of absorbances plus two
standard deviation
of the healthy controls.
The
immunoassay ́s results were discordant when compared on in silico analysis
using as antigen the
synthesize
d sequence.
In another approach, the M antigen was tested in an antigen
-
capture
enzyme
-
linked immunosorbent assay (ELISAs) and promising results were observed, but further
studies must be done in order to evaluate parameters such as sensitivity and specifi
city
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:www.arca.fiocruz.br:icict/9238 |
| Date | January 2013 |
| Creators | Pizzini, Cláudia Vera |
| Contributors | Zancopé Oliveira, Rosely Maria, De Simone, Salvatore Giovanni |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Source | reponame:Repositório Institucional da FIOCRUZ, instname:Fundação Oswaldo Cruz, instacron:FIOCRUZ |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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