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Previous issue date: 2010-03-18 / During the past decades, the development of genetically modified plants became a
consolidated reality. Taking advantage of the genetic engineering process, it is
possible to obtain modified plants to use as bioreactors in the production of tissue or
organs expressing antigens which can be easily used as vaccines. The plant-based
expression systems as tomato and lettuce, which attend as models for that process,
present innumerous advantages such as conservation of eukaryotic machinery,
which promote pos-translational modifications, possibility of large-scale production
and development of safer and economically more attractive vaccines. Taking use of
that strategy, the Swine mycoplasm hyopneumoniae (SMP) disease can be one
important and possible target to either be eradicated or controlled. The SMP, caused
by fastidious bacterium Mycoplasma hyopneumoniae, is one of the most important
respiratory disease in swine breeding, due to its very high prevalence coupled with
associated losses all over the whorld, and has in the recombinant DNA technology a
viable alternative in the development of more effective and safe vaccines The
objective of my work was to genetically manipulate tobacco plants in order to use
them as bioreactor in the production of an antigen against PMS. Tobacco leaves and
internodes were cultured in different concentrations of BAP and AIA hormones. The
best regeneration results for both explants were seen with 1,5mg.L-1 BAP and
0,1mg.L-1 AIA. The selection test with the kanamycin antibiotic appeared to be highly
effective, showing a total inhibition of regeneration with 30 mg.L-1 and 100 mg.L-1 for
leaves and internodes respectively. The recombinant colonies of A. tumefaciens,
containing ltb-r, were co-cultivated with the internodes and leaves from plants
germinated in vitro. The next step, the explants were transferred to the selection
medium in order to induce the selection of the putatively transformed cells. The
genomic DNA from regenerated and putatively transformed plants were extracted
and amplified by PCR, where it was detected the presence of a band referent to ltb
r1. The analyses of the integration and the transcription of ltb-r1 were carried out by
Southern blot and RT-PCR, respectively. In both techniques, it was possible to
confirm the presence of one band which corresponds to the expected size of ltb-r1,
supporting the integration and expression of the gene. However, with the tests used
here, it was not possible to detect with accuracy the recombinant protein / Nas últimas décadas, o desenvolvimento de plantas geneticamente modificadas
tornou-se uma realidade consolidada. Nesse sentido, utilizando-se da engenharia
genética, é possível obter plantas servindo como biorreatores na produção de
tecidos ou orgãos expressando antígenos que podem ser facilmente utilizados como
vacina. Os sistemas de expressão em plantas como tomate, alface, tabaco que
servem como modelos desse processo, apresentam várias vantagens, entre elas, a
conservação da maquinaria eucariótica que promove as modificações póstraducionais das proteínas e ainda a possibilidade de produção em larga escala.
Dentro desta estratégia de produção de proteínas, pode-se citar a pneumonia
micoplásmica suína (PMS), causada pelo agente Mycoplasma hyopneumoniae, uma das
principais doenças de suínos que provoca elevadas perdas econômicas em todo
mundo, e tem, na tecnologia do DNA recombinante, uma alternativa de
desenvolvimento de vacinas mais efetivas. O objetivo do trabalho foi transformar
plantas de tabaco para sua utilização como biorreator na produção de um antígeno
vacinal contra a PMS. Folhas e entrenós foram cultivados em diferentes
concentrações de BAP e AIA. As melhores taxas de regeneração foram encontradas
utilizando 1,5 mg.L-1 de BAP e 0,1 mg.L-1 de AIA para segmentos de folhas e
entrenós. O teste de seleção utilizando canamicina mostrou-se altamente eficiente,
obtendo-se a supressão da regeneração com 30 mg.L-1 e 100 mg.L-1 para
segmentos de folhas e entrenós, respectivamente. Colônias recombinantes de A.
tumefaciens contendo ltb-r1 foram co-cultivadas com entrenós e segmentos foliares de
plantas germinadas in vitro. Após esta etapa, os explantes foram transferidos para
meios de seleção, visando selecionar células possivelmente transformadas. O DNA
genômico das plantas regeneradas e putativamente transformadas foi extraído e
amplificado por PCR, na qual foi possível visualizar uma banda referente ao ltb-r1. A
detecção da integração e transcrição do gene foi realizada por Southern blot e RTPCR, respectivamente. Em ambas as técnicas, foi possível verificar a presença de
uma banda do tamanho esperado para ltb-r1, demonstrando assim, a integração e
expressão do gene. Entretanto, não foi possível detectar com precisão, através dos
testes utilizados, a proteína recombinante.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:repositorio.ufpel.edu.br:123456789/1282 |
| Date | 18 March 2010 |
| Creators | Klafke, Gabriel Baracy |
| Contributors | CPF:12375918953, http://lattes.cnpq.br/0540625238777673, Peters, José Antonio |
| Publisher | Universidade Federal de Pelotas, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia, UFPel, BR, Biotecnologia |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Format | application/pdf |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UFPEL, instname:Universidade Federal de Pelotas, instacron:UFPEL |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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