Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Ceilândia, Programa de Pós-Graduação em Ciências e Tecnologias em Saúde, 2017. / Submitted by Raquel Almeida (raquel.df13@gmail.com) on 2017-11-22T17:06:56Z
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Previous issue date: 2018-01-15 / Fonsecaea pedrosoi, um fungo filamentoso pigmentado devido à produção de melanina, é o principal agente etiológico da Cromoblastomicose (CBM), uma doença com distribuição mundial, mas predominante em países tropicais e subtropicais. A biobalística é uma técnica amplamente utilizada para a direta entrega de material genético em células e tecidos intactos, pelo bombardeamento de partículas. Outro método bem estabelecido numa variedade de fungos é a transformação mediada por Agrobacterium, que consiste na transferência de um T-DNA da bactéria para a célulaalvo. Em F. pedrosoi não há relatos de protocolos estabelecidos para transformação genética, por isso a utilização de qualquer método requer otimização dos parâmetros. Neste estudo, foi utilizada a cepa CBS 271.37de F. pedrosoi para otimizar o bombardeamento de partículas, e transformação mediada por Agrobacterium. Além disto foram construídos vetores contendo marca de resistência à Higromicina B, Nourseotricina e Neomicina. O plasmídeo gGFP contendo o gene da proteína fluorescente GFP, também foi inserido por biobalística em F. pedrosoi para gerar transformantes verde fluorescentes que podem servir como linhagens repórter. Os transformantes obtidos a partir dos vetores contendo as marcas de resistência aos antibióticos foram avaliados quanto à estabilidade mitótica e a presença dos genes de resistência, confirmada por PCR. As condições testadas para biobalística, a distância das partículas às células alvo (6 e 9 cm) e o tempo de recuperação das células em meio não seletivo (24 e 48h), não apresentaram diferença significativa após análises estatísticas. Apesar disto, foi possível observar que um disparo de seis centímetros de distância e um tempo de incubação em meio não seletivo por 24 horas para recuperação das células foi o que proporcionou um maior número de transformantes (37 transformantesµg DNA para o plasmídeo construído neste trabalho, e 45 transformantesµg DNA para o plasmídeo pAN7.1). Nos experimentos com Agrobacterium a proporção de co-cultivo bactéria: fungo de 10:1 108 com tempo de incubação por 72 horas é o que proporciona maior número de transformantes (209 transformantes para plasmídeo pAD1625). Foram selecionados aleatoriamente transformantes resistentes a Higromicina B obtidos por ambas as técnicas para estimar o número de integrações de hph no genoma por Southern blot. Os dados mostraram que a utilização de biobalística para a transformação genética de F.pedrosoi é eficaz, bem como aquela mediada por Agrobacterium. Esta é a primeira vez que uma cepa de Fonsecaea foi geneticamente transformada e estes resultados abrem novas vias para melhor compreender a patobiologia do fungo usando estudos de função gênica. / Fonsecaea pedrosoi, a pigmented filamentous fungus due to the production of melanin, is the main etiological agent of Chromoblastomycosis (CBM), a disease with a worldwide distribution, but predominant in tropical and subtropical countries. Biolistics is a widely used technique for the direct delivery of genetic material to intact cells and tissues by the bombardment of particles. Another well-established method in a variety of fungi is Agrobacterium-mediated transformation, which involves the transfer of a TDNA from the bacterium to the target cell. There are no reports for F. pedrosoi of established protocols for genetic transformation, and then the use of any method requires the optimization of physical and biological parameters. In this study, F. pedrosoi strain CBS 271.37 was used to optimize particle bombardment, and Agrobacterium-mediated transformation. In addition, vectors containing resistance to HygRomycin B, Nourseotricina and Neomycin were constructed. The gGFP plasmid containing the GFP fluorescent protein gene was also inserted by biolistics in F. pedrosoi to generate fluorescent green transformants that can serve as reporter strains. Transformants obtained after plasmids bombardment were evaluated for mitotic stability and the insertion of resistance genes was confirmed by PCR. The conditions tested for biolistics, distance of the particles to the target cells (6 and 9 cm) and time of recovery of the cells in nonselective medium (24 and 48h), did not present significant difference after statistical analyzes. In spite of this, it was possible to observe that six centimeters of distance and an incubation time of 24 hours in non-selective medium for recovery of the cells were the conditions that provided the highest number of transformants (37 transformants μg DNA for the plasmid constructed in this work, and 45 transformants μg DNA for plasmid pAN7.1). In the experiments with Agrobacterium the use of a bacterial: fungus co-culture ratio of 10: 1 108 for 72 hours provided the largest number of transformants (209 transformants for plasmid pAD1625). HygRomycin B resistant transformants were random selected from both methods to estimate the number of integrations of hph into the genome by the Southern blot. The data showed that the use of biolistics for the genetic transformation of conidia of F.pedrosoi is effective, as well as that mediated by Agrobacterium. This is the first time that a Fonsecaea strain has been genetically modified and these results open new avenues to better understand fungal pathobiology using gene function studies.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:repositorio.unb.br:10482/31026 |
| Date | 29 August 2017 |
| Creators | Florencio, Camille Silva |
| Contributors | Matos, Larissa Fernandes |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UnB, instname:Universidade de Brasília, instacron:UNB |
| Rights | A concessão da licença deste item refere-se ao termo de autorização impresso assinado pelo autor com as seguintes condições: Na qualidade de titular dos direitos de autor da publicação, autorizo a Universidade de Brasília e o IBICT a disponibilizar por meio dos sites www.bce.unb.br, www.ibict.br, http://hercules.vtls.com/cgi-bin/ndltd/chameleon?lng=pt&skin=ndltd sem ressarcimento dos direitos autorais, de acordo com a Lei nº 9610/98, o texto integral da obra disponibilizada, conforme permissões assinaladas, para fins de leitura, impressão e/ou download, a título de divulgação da produção científica brasileira, a partir desta data., info:eu-repo/semantics/openAccess |
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