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Previous issue date: 2016-02-26 / FACEPE / O retículo endoplasmático (RE) é uma organela vital para as células eucarióticas, envolvido na síntese, modificação e enovelamento de proteínas, homeostase do cálcio e metabolismo de lipídios. Variações no nível de cálcio, inibição da glicosilação, estresse oxidativo, entre outros, podem levar o RE a uma condição de estresse, a qual dispara vias de sinalização específicas incluindo a Unfolded Protein Response (UPR). A UPR promove aumento na expressão de chaperonas, inibe a tradução de novas proteínas e aumenta a degradação de proteínas mal enoveladas. No entanto, quando o estresse é severo ou persistente, a UPR induz mecanismos de morte celular, principalmente por apoptose. Embora o RE possua papel fundamental na sobrevivência das células de mamíferos, estudos sobre a fisiologia desta organela em Trypanosoma cruzi, agente etiológico da Doença de Chagas, ainda são escassos. Dessa forma, o objetivo deste trabalho foi caracterizar molecular e morfologicamente a resposta de formas epimastigotas de T. cruzi ao estresse do RE induzido por ditiotreitol (DTT) ou tunicamicina (TM). As células tratadas com DTT apresentaram inibição do crescimento de maneira dose-dependente, com recuperação do crescimento após a retirada da droga. O tratamento com DTT não alterou os níveis proteicos de BiP (binding protein) mas reduziu significativamente os níveis de RNAm de BiP e calreticulina (CRT), sugerindo que o T. cruzi tenha uma resposta diferente da UPR de eucariotos superiores. O estresse persistente do RE induzido pelo DTT causou drásticas alterações morfológicas e fisiológicas compatíveis com morte celular por apoptose tardia/necrose, como observado pela dupla marcação com anexina-V e iodeto de propídeo, além da redução do tamanho do corpo celular, inchaço e desorganização das cristas mitocondriais, despolarização do potencial de membrana mitocondrial (ψm) e aumento da produção (21 – 94%) de espécies reativas de oxigênio (ROS). No entanto, a presença de perfis do RE envolvendo porções do citoplasma sugere que a autofagia também esteja ocorrendo. Por outro lado, a TM apresentou um forte efeito tripanostático, sem crescimento celular independentemente da dose ou do tempo de incubação, inclusive após a retirada da droga. O tratamento com a TM também não foi capaz de alterar os níveis proteicos de BiP, porém induziu um aumento nos níveis de RNAm de BiP e CRT. A análise por citometria de fluxo demonstrou que o tratamento com TM induziu despolarização do ψm sem um aumento pronunciado na produção de ROS, e apenas cerca de 10% das células tratadas apresentaram fenótipos de apoptose. Alterações ultraestruturais também foram observadas nas células tratadas com TM, como o arredondamento do corpo celular, a presença de inclusões lipídicas e um grande número de perfis de RE ao redor de estruturas citoplasmáticas em processo de degradação. Dessa forma, nossos resultados sugerem que o tratamento com DTT compromete o funcionamento da célula de maneira geral mais do que atua como estressor do RE, devido ao seu forte efeito oxidativo, levando à morte da célula. Já a TM atua mais especificamente sobre o RE, desencadeando um processo de autofagia/RE-fagia na tentativa de reverter o estresse de RE sem induzir morte celular por apoptose. / The endoplasmic reticulum (ER) is a vital organelle to eukaryotic cells, involved in the protein synthesis, folding and modification, calcium homeostasis and lipid metabolism. Changes in calcium levels, glycosylation inhibition, oxidative stress or others, can lead to an ER stress condition, which triggers specific signaling pathways including the Unfolded Protein Response (UPR). The UPR promotes an increase in the chaperone expression, inhibits the translation of new proteins and increases the degradation of unfolded proteins. However, when the stress is severe or persistent, the UPR induces cell death mechanisms, mainly by apoptosis. Although the ER has a pivotal role in the survival of mammalian cell, studies about the physiology of this organelle in Trypanosoma cruzi, the etiologic agent of Chagas disease, are still scarce. In this regard, the aim of this study was to characterize molecular and morphologically the response of epimastigote forms of T. cruzi to the ER stress induced by dithiothreitol (DTT) or tunicamycin (TM). DTT-treated cells showed a dose-dependent growth inhibition, with growth recovery after drug withdrawal. The DTT treatment did not alter the BiP (binding protein) protein levels but significantly reduced the mRNA levels of BiP and calreticulin (CRT), suggesting that T. cruzi has a different response from higher eukaryotes UPR. Persistent ER stress induced by DTT caused drastic morphological and physiological changes compatible with cell death by late apoptosis/necrosis, as observed by double staining with annexin-V and propidium iodide, reduction of cell body, swelling and disorganization of mitochondrial cristae, mitochondrial membrane potential (ψm) depolarization and increasing of reactive oxygen species (ROS) production (21-94%). However, the presence of ER profiles involving cytoplasmic portions suggests that autophagy may also be occurring. On the other hand, the TM showed strong trypanostatic effect, with no cell growth observed independent of the dose and the time of incubation, even after drug withdrawal. The TM treatment was also unable to change the BiP protein levels, but induced an increase in BiP and CRT mRNA levels. The flow cytometry analysis showed that TM-treatment induced ψm depolarization without a pronounced increase in the ROS production (10 - 15%) and only about 10% of the treated cells exhibited apoptotic phenotypes. Ultrastructural changes were also observed in TM-treated cells, such as rounding of the cell body, the presence of lipid inclusions and a large number of ER profiles surrounding cytoplasmic structures in degradation process. Therefore, our results suggest that the DTT treatment compromises the whole cell function rather than acts as a specific inductor of ER stress, due to its strong oxidative effect, leading to cell death. The TM treatment acts more specifically on the ER, triggering an autophagy/ER-phagy process in an attempt to reverse the ER stress, without inducing cell death by apoptosis.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:repositorio.ufpe.br:123456789/17356 |
| Date | 26 February 2016 |
| Creators | SANDES, Jana Messias |
| Contributors | FONTES, Adriana, FIGUEIREDO, Regina C. B. Q. |
| Publisher | Universidade Federal de Pernambuco, Programa de Pos Graduacao em Ciencias Biologicas, UFPE, Brasil |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UFPE, instname:Universidade Federal de Pernambuco, instacron:UFPE |
| Rights | Attribution-NonCommercial-NoDerivs 3.0 Brazil, http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/br/, info:eu-repo/semantics/openAccess |
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