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Previous issue date: 2001 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Durante os processos de rejeicao de alo e xenotransplantes, celulas endoteliais (CE) transformam-se e passam a apresentar caracteristicas fenotipicas pro-inflamatorias e protromboticas. Alguns membros da familia de genes Bcl-2 (bcl-2, bclx1 e A1) exercem uma dupla funcao protetora em CE, ou seja, protecao contra apoptose e inflamacao. Essa ultima funcao esta diretamente ligada a inibicao do fator de transcricao NF-kB, que e fundamental para a inducao dos principais genes pro-inflamatorios na CE: E-seletina, VCAM-1, IL-8, MCP-1, fator tecidual e PAI-1. Diferentemente de bcl-2 Bcl-Xl1 , o gene A1 nao expressa-se constitutivamente em CE, mas de forma induzida por mediadores pro-inflamatorios tais como LPS ou TNF. O gene A1 codifica 3 dominios homologos ao bcl-2 (denominados BH1, BH2 e BH4) e nao apresenta o dominio pro-apoptotico BH3. Membros da familia de onco-proteinas Bcl-2 apresentam ainda um dominio carboxi-terminal transmembrana (TM), responsavel pelo ancoramento das mesmas a membrana mitocondrial. Estudos previos demonstraram que a funcao inibitoria do fator NF-kB pelo gene bcl-2 relaciona-se ao dominio BH4 enquanto o papel do dominio TM com relacao as funcoes protetoras exercidas por membros da familia Bcl-2 em CE ainda nao foi completamente estabelecido. Os objetivos principais deste estudo foram o de avaliar as funcoes protetoras (anti-apoptotica e anti-inflamatoria) do gene A1 transferido para CE; mapear as mesmas funcoes, correlacionando-as aos dominios BH4 e TM. A confirmacao das funcoes protetoras do gene A1 transferido para CE podera abrir perspectivas para sua utilizacao futura na terapia genetica de patologias onde a apoptose e inflamacao de CE sejam observadas. Utilizando-se a tecnica de amplificacao por polimerase em cadeia (PCR) com overlap extension (OLE-PCR), deletamos o dominio BH4 do gene A1 proveniente de cDNA marcado com hemaglutinina (HA), usando primers especificos. Também por PCR,
deletamos o domínio TM de A1. Após confirmação, por sequenciamento genético automatizado, das mutações dirigidas e amplificação por PCR, os produtos (A1DBH4 ou A1TM) foram inseridos em plasmídeos de expressão (pAC), sob controle de um promotor CMV. Da mesma forma, construimos um plasmídeo expressando uma sequência repetida
(4X) do domínio BH4 de A1 (polyA1BH4). Células aórticas bovinas (BAEC) em cultura foram co-transfectadas pela técnica de lipossomas não catiônicos, permitindo a transferência do gene A1 wild type ou de seus mutantes (A1DBH4 ou polyBH4), além dos genes repórteres luciferase-NF-kB e b-galactosidase. A expressão proteica foi confirmada
por immunoblotting, utilizando-se anticorpos monoclonais anti-HA. A deleção do domínio BH4 anulou ambas funções anti-inflamatória e anti-apoptótica do gene A1 em CE. A expressão da proteína A1 desprovida do domínio BH4 (A1DBH4) foi incapaz de inibir a indução do reporter NF-kB por TNF, e não exerceu proteção das CE contra apoptose
induzida por TNF-cicloheximida. A deleçnao do domínio TM não afetou as funções protetoras de A1 nas CE estudadas. Entretanto, a expressão da proteína polyA1BH4 em BAEC reproduziu completamente a função anti-inflamatória da proteína A1 wild-type. Finalmente, construimos um adenovírus recombinante codificando o gene A1 desprovido de domínio transmembrana (rAd.A1DTM). O sucesso na transferência genética de A1, mediada por adenovírus, para das CE porcinas (PAEC) foi confirmado, através de immunoblotting e por imuno-histoquímica,, pela expressão da proteína transgênica A1 em
aproximadamente 100% de células infectadas. Esses resultados demonstram que a transferência do gene A1 para CE é possível através da utilização de vetores virais e nãovirais. Nosso estudo demonstra ainda que o domínio BH4, capaz de interagir em outros genes da família Bcl-2 com moléculas de sinalização como Ras, Raf-kinase e alcineurina, é necessário e suficiente para a função anti-inflamatória, e necessário para a função antiapoptótica, de A1, enquanto o domínio TM não é necessário para as mesmas funções em CE. A definição dos sítios de interação do domínio BH4 de A1 com outras moléculas de
sinalização poderá revelar novos candidatos potenciais para o tratamento farmacológico ou genético de doenças onde o processo de ativação e apotose de CE estejam envolvidos, tais como a rejeição aguda ou crônica de alo e xenotransplantes. / Acquisition by endothelial cells (EC) of a pro-inflammatory phenotype as well as apoptosis
are common features of allo and xenograft rejection. It has been shown that the Bcl family
members bcl-2, bcl-xL and A1 mediate a dual cytoprotective function in EC i.e. protection
from apoptosis and prevention of inflammation. This latter function relates to the inhibition
of the transcription factor NF-kB that is required for the induction of most proinflammatory
genes in EC such as E-selectin, VCAM-1, IL-8, MCP-1, Tissue Factor and PAI-
1. Unlike bcl-2 or bcl-xL, A1 is not constitutively expressed in EC but rather induced by
pro-inflammatory mediators such as LPS or TNFa. The A1 gene encodes 3 Bcl homology
domains - BH1, BH2 and BH4 - but is devoid of the pro-apoptotic BH3 domain. Previous
studies have shown that, in bcl-2, most of NF-kB inhibitory function resides within the BH4
domain. The aim of this study was to map the protective anti-apoptotic and antiinflammatory
functions of A1 in EC, considering the possibility of its use in gene therapy.
The BH4 domain of HA-tagged human A1cDNA was deleted by overlap-extension PCR
using 2 pairs of selected primers and its sequence confirmed (A1DBH4). The PCR product
was further cloned into the pAC expression plasmid under the control of the CMV
promoter. Similar strategy was used to construct a “BH4-only” plasmid (polyA1BH4)
consisting of a repetitive sequence (4X) of the BH4 domain of A1. Bovine aortic endothelial
cells (BAEC) were co-transfected, using cationic liposome-mediated gene transfer, with A1
or A1 mutant expression plasmids (wild type A1, A1DBH4 or polyBH4), a luciferase-NF-kB
reporter and a b-galactosidase reporter. Protein expression was demonstrated by western
blot using an anti-HA MoAb. Deletion of the BH4 domain abrogated both the inhibitory
effect of A1 upon NF-kB activation and its anti-apoptotic function. Expression of A1DBH4 in EC has neither inhibited LPS or TNF-mediated induction of the NF-kB reporter nor
cyclohexamide/TNF-mediated apoptosis. Expression of polyA1BH4 fully reproduced the
anti-inflammatory and anti-apoptotic effects of wild type A1. Finally, we have constructed
a recombinant adenovirus coding for the A1 gene deleted from its transmembrane domain
(rAd.A1DTM). PAEC infected with rAd.A1DTM have successfully expressed the A1
transgene protein in approximately 100% of cells. Our results indicate that A1 gene
transfer to EC is feasible and can be achieved using viral and non-viral vectors. Our study
shows that the BH4 domain of A1, which has been shown in other bcl genes to interact
with molecules involved in signaling, such as Ras, Raf-kinase and calcineurin, is necessary
and sufficient for the anti-inflammatory function of A1 in EC. Defining the targets of the
BH4 domain of A1 in EC may reveal new potential therapeutic candidates in diseases
where EC activation and apoptosis are involved, such as allo and xenograft rejection. / BV UNIFESP: Teses e dissertações
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:repositorio.unifesp.br:11600/17558 |
| Date | January 2001 |
| Creators | Rocha, Eduardo [UNIFESP] |
| Contributors | Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), Pacheco-Silva, Alvaro [UNIFESP] |
| Publisher | Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP) |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Format | 134 p. |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UNIFESP, instname:Universidade Federal de São Paulo, instacron:UNIFESP |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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