Les technologies CRISPR-Cas9 révolutionnent la façon dont on interroge les systèmes biologiques et offrent un immense potentiel thérapeutique pour diverses maladies génétiques. Malgré les progrès fulgurants des dernières années, l'ingénierie ciblée du génome des cellules humaines demeure un défi de taille dans certains types cellulaires. La cosélection sans marqueur est une méthode qui consiste à introduire une mutation précise dans un gène endogène pour conférer de la résistance à une molécule toxique pour les cellules non modifiées, permettant l'enrichissement des cellules modifiées par CRISPR-Cas9. Comme deux différents évènements de modifications génétiques ne sont pas statistiquement indépendants au sein d'une même cellule, la sélection des cellules ayant la première modification permet l'enrichissement d'une deuxième modification d'intérêt à un locus distant par cosélection. Dans le cadre du premier chapitre de cette thèse, nous avons développé une méthode de cosélection pour permettre l'enrichissement des cellules modifiées par éditeur de type PE, de l'anglais pour « prime editing ». Nous avons identifié des mutations dominantes avec gain de fonction du gène ATP1A1 qui confèrent différents niveaux de résistance à l'ouabaïne, un inhibiteur de la pompe à sodium/potassium (ATPase Na⁺/K⁺). Ces nouvelles mutations permettent d'effectuer jusqu'à trois étapes successives de cosélection en augmentant la dose d'ouabaïne à chape étape. La cosélection facilite grandement l'enrichissement de populations de cellules hautement modifiées et l'isolement de clones dérivés d'une seule cellule homozygote pour une modification désirée. La caractérisation des clones a révélé que l'utilisation de l'éditeur PE3 génère fréquemment des modifications non voulues et plus difficiles à détecter étant donné leurs plus grandes tailles. En somme, nos méthodes devraient faciliter l'ingénierie ciblée du génome des cellules humaines pour créer des modèles cellulaires pour la recherche biomédicale. Dans le cadre du deuxième chapitre de cette thèse, nous avons développé une méthode de sélection sans marqueur pour l'ingénierie ciblée du génome des lymphocytes T pour diverses applications en thérapie cellulaire. Cette méthode permet de simultanément intégrer un transgène codant pour un récepteur antigénique chimérique (CAR) et une mutation gain de fonction dans le locus MTOR. Cette mutation permet la sélection sans marqueur avec la rapamycine, un inhibiteur de mTOR couramment utilisé en clinique comme immunosuppresseur. Notre approche permet donc d'enrichir les cellules modifiées par CRISPR-Cas9 qui expriment un transgène thérapeutique d'intérêt. À partir d'un rapporteur fluorescent de signalisation mTORC1, nous avons démontré que mTOR demeure fonctionnelle en présence de rapamycine après l'intégration du transgène d'intérêt et de la mutation dominante. Cette méthode permet l'enrichissement efficace de lymphocytes T primaires exprimant un récepteur CD19-CAR. À partir d'essais de cytotoxicité in vitro et d'un modèle murin de leucémie lymphoblastique aiguë, nous avons observé un effet combiné des lymphocytes CAR-T et de la rapamycine en ciblant des lymphocytes B cancéreux (CD19⁺). En somme, notre stratégie devrait faciliter l'ingénierie ciblée du génome des lymphocytes T pour diverses applications en thérapie cellulaire. / CRISPR-based technologies are revolutionizing the way we interrogate biological systems, and offer a diverse array of therapeutic opportunities to treat genetic diseases. Despite significant improvements, genome editing in human cells remains challenging in a variety of cell types. Marker-free co-selection is based on the installation of a specific mutation at an endogenous locus to confer cellular resistance to a molecule that is otherwise toxic for unmodified cells, allowing the enrichment of CRISPR-engineered cells. Considering that two genome editing events at distant loci are not statistically independent within the same cell, selection for the first modification allows the enrichment of a second modification of interest via co-selection. As part of the first chapter of this thesis, we developed a marker-free co-selection method to perform successive rounds of prime editing in human cells. We first identified new ATP1A1 gain-of-function mutations to confer different levels of resistance to ouabain, a plant-derived inhibitor of the essential and ubiquitous sodium-potassium pump (Na⁺/K⁺ ATPase). Introducing these mutations sequentially allowed up to three successive rounds of selection to be performed by increasing the dose of ouabain at each step. Co-selection greatly facilitates the isolation of highly-modified populations of cells and homozygous single cell-derived clones. Characterization of single cell-derived clones revealed that the use of a complementary nick sgRNA (PE3) frequently generates tandem duplications and large deletions at the target site. Overall, our co-selection toolkit should facilitate prime editing in human cells to create cellular models for biomedical research. As part of the second chapter of this thesis, we have developed a marker-free selection method to enrich CRISPR-engineered T cells for cell therapy applications. We devised a strategy to simultaneously introduce a rapamycin resistance mutation and a CAR gene cassette to the MTOR locus via intron nesting to generate rapamycin-resistant CD19-CAR-T cells. Our strategy allows the enrichment of CRISPR-engineered T cells expressing a therapeutic transgene of interest with rapamycin, a widely used immunosuppressant. Using a fluorescent mTORC1 signaling reporter, we confirmed that mTORC1 signaling remained functional in the presence of rapamycin after the installation of the dominant gain-of-function mutation and a therapeutic transgene of interest. Using luciferase-based and FACS-based in vitro cytotoxicity assays, and a mouse model of acute lymphoblastic leukemia, we confirmed that our CAR-T cells could efficiently target CD19⁺ leukemia cells in combination with rapamycin. We foresee that our strategy could both facilitate the enrichment of CRISPR-engineered CAR-T cells and improve tumor eradication.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:LAVAL/oai:corpus.ulaval.ca:20.500.11794/105345 |
| Date | 13 December 2023 |
| Creators | Levesque, Sébastien |
| Contributors | Doyon, Yannick |
| Source Sets | Université Laval |
| Language | French |
| Detected Language | French |
| Type | COAR1_1::Texte::Thèse::Thèse de doctorat |
| Format | 1 ressource en ligne (xvii, 223 pages), application/pdf |
| Rights | http://purl.org/coar/access_right/c_abf2 |
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