Les technologies CRISPR-Cas9 révolutionnent la façon dont on interroge les systèmes biologiques et offrent un immense potentiel thérapeutique pour diverses maladies génétiques. Malgré les progrès fulgurants des dernières années, l'ingénierie ciblée du génome des cellules humaines demeure un défi de taille dans certains types cellulaires. La cosélection sans marqueur est une méthode qui consiste à introduire une mutation précise dans un gène endogène pour conférer de la résistance à une molécule toxique pour les cellules non modifiées, permettant l'enrichissement des cellules modifiées par CRISPR-Cas9. Comme deux différents évènements de modifications génétiques ne sont pas statistiquement indépendants au sein d'une même cellule, la sélection des cellules ayant la première modification permet l'enrichissement d'une deuxième modification d'intérêt à un locus distant par cosélection. Dans le cadre du premier chapitre de cette thèse, nous avons développé une méthode de cosélection pour permettre l'enrichissement des cellules modifiées par éditeur de type PE, de l'anglais pour « prime editing ». Nous avons identifié des mutations dominantes avec gain de fonction du gène ATP1A1 qui confèrent différents niveaux de résistance à l'ouabaïne, un inhibiteur de la pompe à sodium/potassium (ATPase Na⁺/K⁺). Ces nouvelles mutations permettent d'effectuer jusqu'à trois étapes successives de cosélection en augmentant la dose d'ouabaïne à chape étape. La cosélection facilite grandement l'enrichissement de populations de cellules hautement modifiées et l'isolement de clones dérivés d'une seule cellule homozygote pour une modification désirée. La caractérisation des clones a révélé que l'utilisation de l'éditeur PE3 génère fréquemment des modifications non voulues et plus difficiles à détecter étant donné leurs plus grandes tailles. En somme, nos méthodes devraient faciliter l'ingénierie ciblée du génome des cellules humaines pour créer des modèles cellulaires pour la recherche biomédicale. Dans le cadre du deuxième chapitre de cette thèse, nous avons développé une méthode de sélection sans marqueur pour l'ingénierie ciblée du génome des lymphocytes T pour diverses applications en thérapie cellulaire. Cette méthode permet de simultanément intégrer un transgène codant pour un récepteur antigénique chimérique (CAR) et une mutation gain de fonction dans le locus MTOR. Cette mutation permet la sélection sans marqueur avec la rapamycine, un inhibiteur de mTOR couramment utilisé en clinique comme immunosuppresseur. Notre approche permet donc d'enrichir les cellules modifiées par CRISPR-Cas9 qui expriment un transgène thérapeutique d'intérêt. À partir d'un rapporteur fluorescent de signalisation mTORC1, nous avons démontré que mTOR demeure fonctionnelle en présence de rapamycine après l'intégration du transgène d'intérêt et de la mutation dominante. Cette méthode permet l'enrichissement efficace de lymphocytes T primaires exprimant un récepteur CD19-CAR. À partir d'essais de cytotoxicité in vitro et d'un modèle murin de leucémie lymphoblastique aiguë, nous avons observé un effet combiné des lymphocytes CAR-T et de la rapamycine en ciblant des lymphocytes B cancéreux (CD19⁺). En somme, notre stratégie devrait faciliter l'ingénierie ciblée du génome des lymphocytes T pour diverses applications en thérapie cellulaire. / CRISPR-based technologies are revolutionizing the way we interrogate biological systems, and offer a diverse array of therapeutic opportunities to treat genetic diseases. Despite significant improvements, genome editing in human cells remains challenging in a variety of cell types. Marker-free co-selection is based on the installation of a specific mutation at an endogenous locus to confer cellular resistance to a molecule that is otherwise toxic for unmodified cells, allowing the enrichment of CRISPR-engineered cells. Considering that two genome editing events at distant loci are not statistically independent within the same cell, selection for the first modification allows the enrichment of a second modification of interest via co-selection. As part of the first chapter of this thesis, we developed a marker-free co-selection method to perform successive rounds of prime editing in human cells. We first identified new ATP1A1 gain-of-function mutations to confer different levels of resistance to ouabain, a plant-derived inhibitor of the essential and ubiquitous sodium-potassium pump (Na⁺/K⁺ ATPase). Introducing these mutations sequentially allowed up to three successive rounds of selection to be performed by increasing the dose of ouabain at each step. Co-selection greatly facilitates the isolation of highly-modified populations of cells and homozygous single cell-derived clones. Characterization of single cell-derived clones revealed that the use of a complementary nick sgRNA (PE3) frequently generates tandem duplications and large deletions at the target site. Overall, our co-selection toolkit should facilitate prime editing in human cells to create cellular models for biomedical research. As part of the second chapter of this thesis, we have developed a marker-free selection method to enrich CRISPR-engineered T cells for cell therapy applications. We devised a strategy to simultaneously introduce a rapamycin resistance mutation and a CAR gene cassette to the MTOR locus via intron nesting to generate rapamycin-resistant CD19-CAR-T cells. Our strategy allows the enrichment of CRISPR-engineered T cells expressing a therapeutic transgene of interest with rapamycin, a widely used immunosuppressant. Using a fluorescent mTORC1 signaling reporter, we confirmed that mTORC1 signaling remained functional in the presence of rapamycin after the installation of the dominant gain-of-function mutation and a therapeutic transgene of interest. Using luciferase-based and FACS-based in vitro cytotoxicity assays, and a mouse model of acute lymphoblastic leukemia, we confirmed that our CAR-T cells could efficiently target CD19⁺ leukemia cells in combination with rapamycin. We foresee that our strategy could both facilitate the enrichment of CRISPR-engineered CAR-T cells and improve tumor eradication.

La dystrophie musculaire de Duchenne est une myopathie héréditaire récessive liée au chromosome X. Elle est causée par l’absence de la dystrophine dans les fibres musculaires. La thérapie cellulaire est l’une des approches thérapeutiques possibles, mais son succès dépend du contrôle du rejet des myoblastes greffés et des fibres musculaires hybrides. À présent, le contrôle du rejet est obtenu par l’administration d’immunosuppresseurs puissants. Notre objectif à long terme est de développer un protocole de tolérance immunologique qui permettrait de prévenir le rejet, sans recours à une immunosuppression soutenue. La première étape du protocole de tolérance immunologique que nous souhaitons développer est d’induire la formation de lymphocytes T régulateurs en utilisant le facteur de transcription Foxp3. Nos travaux nous ont permis de produire, dans des bactéries E. coli, la protéine de fusion Tat-Foxp3. Par des essais in vitro nous avons démontré l’augmentation de l’expression du récepteur CD25 sur les lymphocytes T CD4+ naïfs après transduction de la protéine Tat-Foxp3. Cela suggère que la protéine Tat-Foxp3 pourrait convertir les lymphocytes T CD4+ naïfs en lymphocytes T régulateurs. D’autres travaux seront nécessaires pour confirmer que ces cellules exprimant le CD25 sont vraiment des T régulateurs. / The Duchenne muscular dystrophy is the most common hereditary muscular disease. This disease is inherited as an X-linked recessive trait. It is caused by the absence of dystrophin in muscle fibers. Cell therapy is the potential treatment but, its success depends on the control of the rejection of the transplanted myoblasts and of the hybrid fibers that they formed. At present, the control of the graft rejection is achieved by administration of powerful immunosuppressive drug. Our long-term aim is to develop a protocol for immune tolerance that would prevent the graft rejection without sustained immunosuppression. The first step of this tolerance protocol that we want to develop is to induce the formation of regulatory T cells using the transcription factor Foxp3. In this study we generated, in bacteria E. coli, a fusion protein Tat-Foxp3. By in vitro assays, we demonstrated that Tat-Foxp3 protein up-regulated the expression of CD25 in naïve CD4+ T cells. Additional experiments will be required to confirm that these CD25 expressing cells are Treg.

Objectifs : Les thérapies régénératives cardiaques ont connu un essor considérable au cours des 10 dernières années. Malgré des effets positifs démontrés chez l’animal, les bénéfices cliniques obtenus chez l’homme sont encore relativement modestes. L’objectif de ce travail a été de mieux comprendre les facteurs liés à l’implantation des cellules souches grâce aux techniques de détection cellulaire en imagerie par résonance magnétique (IRM), afin d’optimiser la thérapie cellulaire cardiaque.Matériel et méthodes : Un protocole de détection cellulaire en IRM cardiaque in vivo ainsi qu’une méthode de détection des microvaisseaux en IRM cardiaque ex vivo haute résolution avec des séquences Susceptibility Weighted Imaging (SWI) ont été développés, puis mis en application pour l’étude de la vectorisation de progéniteurs des cellules endothéliales marqués magnétiquement par des nanoparticules d’oxyde de Fer et injectés par voie intraveineuse, ainsi que pour l’évaluation de l’intégration et de l’efficacité de cellules souches mésenchymateuses administrées via des patchs de fibrine cellularisés chez des rats adultes indemnes de toute pathologie (un groupe contrôle vs un groupe infarctus via ligature définitive de l’artère interventriculaire antérieure).Résultats : Après injection intraveineuse et malgré la vectorisation magnétique (n=16 rats), l’imagerie de détection cellulaire a montré qu’aucune cellule n’était implantée dans le myocarde et que les paramètres fonctionnels cardiaques n’étaient pas améliorés. Avec les patchs cellularisés (n=37 rats), la fraction d’éjection ventriculaire gauche (FEVG) était améliorée dans les groupes de patchs cellularisés par rapport aux groupes contrôles. La densité microvasculaire était augmentée dans la zone infarcie et peri-infarcie dans les groupes cellularisés par rapport aux groupes contrôles, à la fois en immunohistochimie et en IRM sur les séquences SWI. L’IRM a montré l’absence de migration des cellules dans le myocarde à partir du patch, confirmé en immunohistochimie. La persistance de cellules dans la zone d’implantation du patch à la surface épicardique à J21 post greffe et l’étude en cytométrie en flux des cytokines et facteurs de croissance produits par les cellules souches plaident pour une efficacité de la thérapie cellulaire en rapport avec la sécrétion de facteurs paracrines par les cellules souches.Conclusion : L’imagerie de susceptibilité magnétique permet d’une part d’étudier les vaisseaux myocardiques sur des séquences pondérées en SWI ex vivo et d’autre part d’évaluer l’implantation des cellules souches sur des séquences en écho de gradient T2* in vivo. Ces techniques ont permis de mieux caractériser le mode d’action des patchs cardiaques en tant que réservoir de facteurs paracrines pour le traitement de l’insuffisance cardiaque dans un modèle murin. Ces résultats confirment l’intérêt fort à développer et optimiser l’utilisation de biomatériaux intelligents délivrant spécifiquement des molécules d’intérêt comme les cytokines ou les facteurs de croissance et permettant ainsi de contourner les contraintes immunogènes et tératogènes liés aux cellules souches. / Objectives: Cardiac regenerative therapies have grown considerably over the past 10 years. Despite positive effects demonstrated in animals, the clinical benefits obtained in humans are still relatively modest. The objective of this work was to better understand the factors associated with implantation of stem cells through the cell detection techniques in magnetic resonance imaging (MRI) and to improve cardiac stem cell therapy in a murine model of myocardial infarction.Materials and methods: A protocol for cell detection with gradient echo T2* sequences in cardiac MRI in vivo and a method for detection of microvessels in cardiac MRI ex vivo with high resolution Susceptibility Weighted Imaging sequences (SWI) were developed and implemented for the study of vectorization of intravenously injected endothelial progenitors cells (EPC) and the integration and evaluation of the impact of mesenchymal stem cells (MSC) administered via cellularized fibrin patches. A permanent ligation of the left anterior coronary artery was performed in adult rats. The stem cells were magnetically labeled with iron oxide nanoparticles by endocytosis.Results: Cell detection imaging showed no cell implantation in the myocardium and no improvement in cardiac functional parameters after intravenous injection of EPC, despite the aid of magnetic vectorization (n = 16 rats). With a local administration of MSC via cardiac patches (n = 37 rats), the left ventricular ejection fraction (LVEF) was improved in cellularized patches groups compared to controls. Microvascular density was increased in the infarcted and peri – infarcted areas in cellularized patches groups compared to controls in immunohistochemistry and in MRI on SWI sequences. The MRI showed no migration of cells into the myocardium from the patch, as confirmed by immunohistochemistry and Perls staining. The persistence of MSCs on the epicardial surface at D21 after implantation and flow cytometry profiling of cytokines and growth factors produced by MSC argue for cell therapy effectiveness related to the secretion of paracrine factors by stem cells.Conclusion: Susceptibility imaging allows: (1) to study myocardial vessels on SWI sequences ex vivo and (2) to assess the implementation of stem cells on gradient echo sequences T2 * in vivo. These techniques have shown that cardiac patches act as a reservoir of soluble mediators which paracrinally target the angiogenesis in the treatment of heart failure in a murine model. This is in favor of a move towards “cell free” biomaterials containing only molecules of interest such as cytokines or growth factors to circumvent immunogenic and teratogenic constraints related to the use of stem cells.

Les maladies cardiovasculaires sont une des premières causes de mortalité dans les pays industrialisés. L'infarctus du myocarde provoque la mort d'un grand nombre de cellules cardiaques, diminuant la qualité de vie des gens qui survivent à une telle attaque. La transplantation d'un organe entier présente des limites telles que la faible quantité de donneurs et la possibilité de rejet par l'organisme du receveur. Le cœur possède une capacité de se régénérer mais le nombre de cellules souches résidentes pouvant accomplir cette tâche apparaît être insuffisant. Afin d'aider à la régénération, des approches thérapeutiques tentent l'implantation de cellules fonctionnelles dans la zone infarcie. Les cellules implantées sont, entre autres, des myoblastes squelettiques, des cellules souches embryonnaires ou adultes (cellules souches mésenchymateuses) indifférenciées, des cardiomyocytes fœtaux. Les résultats positifs parfois obtenus ont vite fait passer ces études des animaux à l'humain. La mise au point de thérapies cellulaires efficaces pour le cœur nécessite la compréhension des mécanismes moléculaires gouvernant la différenciation et la morphogénèse cardiaques, et l'habileté à manipuler ces mécanismes. Les cellules de carcinome embryonnaire P19, un modèle de cellules souches embryonnaires (ES), peuvent se différencier en cardiomyocytes lorsqu'elles sont traitées avec l'acide rétinoïque (AR) ou l'ocytocine (OT). Des cellules de muscle squelettique sont aussi générées. D'autre part, l'AR permet la différenciation de cellules ES en adipocytes et l'OT inhibe la maturation finale de pré-adipocytes. Nous avons émis l'hypothèse que l'AR et l'OT peuvent induire les cellules P19 à générer, de façon concomitante mais dans des rapports différents, des adipocytes, cardiomyocytes et cellules de muscle squelettique. De plus, des analogues de l'AR capables d'activer préférentiellement les récepteurs de l'acide rétinoïque (RAR) ou les récepteurs de rétinoïdes-X (RXR) pourraient influencer les rapports mésodermiques. Enfin, les kinases ERK1/2 et P38, des protéines-kinases activées par des mitogènes (MAPK), pourraient avoir un rôle dans la différenciation mésodermique induite par l'AR et l'OT. Des marqueurs ont servi à identifier les phénotypes cellulaires : PPARy, aP2, lipoprotéines-lipase et gouttelettes lipidiques colorables à l'huile rouge pour les adipocytes; MyoD et α-actinine sarcomérique pour les cellules de muscle squelettique; troponine I cardiaque (cTpnI), chaîne légère de la myosine cardiaque-2v et α-actinine sarcomérique pour les cardiomyocytes. La culture en agrégats de cellules P19 pendant sept jours, avec une induction à l'AR entre les jours deux (J2) et J5, suivie d'une période de maturation de 20 jours en présence d'insuline et de l'hormone thyroïdienne T3 permet d'obtenir des adipocytes. Des cellules battantes exprimant l'α-actinine sarcomérique sont aussi générées. Une importante proportion de ces cellules montre la forme allongée ou fibrillaire caractéristique de myocytes squelettiques. Une faible proportion a une forme arrondie et exprime la cTpnI, indiquant la génération de cardiomyocytes. L'induction des cellules P19 avec l'AR, à J2, a donc un effet mésodermique large. L'ajout d'OT au milieu de maturation n'augmente pas la proportion de cellules cardiaques par rapport aux cellules musculaires squelettiques ou aux adipocytes. L'AR agit principalement en se liant aux RAR et RXR. Pour activer de façon spécifique chacune de ces deux familles de récepteurs, nous avons remplacé l'AR comme agent inducteur par le LG100268, un agoniste spécifique des RXR, ou par le TTNPB, un agoniste spécifique des RAR. Le LG100268 génère des adipocytes et des myocytes aussi efficacement que l'AR. Le TTNPB est un agent adipogénique plus efficace que l'AR mais inhibe la myogenèse. Les influences mésodermiques différentes des trois agents sont associées à des actions différentes sur ERK1/2 et P38. Ainsi, l'AR et le LG100268 diminuent similairement phospho-ERK1/2 et augmentent similairement phospho-P38. Par contre, le TTNPB, le rétinoïde le plus efficace à diminuer phospho-ERK.1/2, n'a pas stimulé la phosphorylation de P38. L'inhibition pharmacologique d'ERK1/2 ou de P38 pendant le traitement des cellules avec l'AR a augmenté le rendement myogénique, et l'inhibition de P38 a, de plus, augmenté le rendement adipogénique. La voie des RXR est permissive à la fois à l'adipogenèse et à la myogenèse alors que celle des RAR n'est permissive qu'à l'adipogenèse. P38 serait un régulateur négatif de l'adipogénèse. La différenciation à base d'OT produit des cardiomyocytes et, dans une moindre mesure, des cellules de muscle squelettique. L'OT est ajouté durant les quatre jours de l'agrégation et la période de maturation est de dix jours. Les rendements myogéniques sont faibles et nous avons pensé que l'ajout d'AR à l'OT pouvait les augmenter. Lorsqu'il est ajouté dès le J0 du traitement des cellules avec l'OT (addition précoce), l'AR inhibe la myogenèse. Cette inhibition est reliée aux RAR puisqu'elle est reproduite par le TTNPB et non le LG100268. Étonnamment, l'AR ajouté au J2 du traitement avec l'OT (addition tardive) fait plus que doubler le rendement des cellules musculaires, spécialement celui des cellules de muscle squelettique. L'AR a donc un effet dual, temporellement régulé, sur l'action myogénique de l'OT. Un tel effet est aussi observé sur la phosphorylation d'ERK1/2. OT stimule cette phosphorylation, et la stimulation est fortement inhibée par l'addition précoce mais non tardive d'AR. L'inhibition pharmacologique d'ERK1/2 abolit l'action myogénique d'OT. Par contre, l'ajout d'un activateur indirect d'ERK2 à la combinaison "OT + AR tardif" augmente la phosphmylation d'ERK1/2 ainsi que le rendement en cardiomyocytes. Des niveaux de phospho-ERK1/2 sont critiques pour la myogénèse et pour les rendements respectifs en cardiomyocytes et cellules de muscle squelettique. En conclusion, les cellules P19 génèrent adipocytes, cardiomyocytes et cellules de muscle squelettique de façon concomitante lorsqu'elles sont induites avec l'AR. Dans ce processus, l'activation des RAR n'est permissive qu'à l'adipogenèse alors que celle des RXR permet l'adipogenèse et la myogenèse. L'action antimyogénique de l'activation des RAR est aussi observée en présence d'OT, cependant cette action ne se manifeste que si l'activation est faite tôt (J0). AR et OT influencent chacun la phosphorylation de MAPK et, réciproquement, leur action mésodermique est influencée par des modulateurs pharmacologiques de ces kinases. Le sens des influences peut cependant différer. Ainsi, les meilleurs rendements myogéniques ont été observés pour les traitements suivants : "AR + inhibiteur d'ERK (J2 à J5)", "AR + inhibiteur de P38 (J2 à J5)", "OT (J0 à J4) + AR (J2 à J4)", "OT + activateur d'ERK (J0 à J4) + AR (J2 à J4)". La modulation de l'activité des voies RAR, RXR et MAPK a une influence sur les rendements myogéniques et adipogéniques ainsi que sur les rendements en cardiomyocytes et en cellules de muscle squelettique. Le sens de l'influence dépend de la fenêtre temporelle de la modulation et de la présence ou non de l'OT. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : Cardiomyocytes, Cellules de muscle squelettique, Adipocytes, Acide rétinoïque, Ocytocine, Rétinoïdes, MAPK, ERK, P38, PCR, Immunobuvardage, Cytofluorescence, Cytochimie

L’arthrose est une maladie ostéoarticulaire fréquente et sans traitement curatif. Elle se manifeste par une dégénérescence du cartilage, associée à une altération des autres tissus de l’articulation. Dans ce contexte, les cellules souches mésenchymateuses (CSM) démontrent un effet thérapeutique. Afin d’identifier de nouveaux médiateurs de l’homéostasie articulaire, nous avons analysé le secrétome des CSM en nous focalisant sur les membres de la famille du facteur de croissance transformant β (TGFβ), une voie centrale dérégulée dans l’arthrose.Cette approche nous a permis d’identifier la protéine induite par le TGFβ (TGFβI ou βIGH3), pour laquelle nous avons évalué le rôle dans la différenciation des CSM et comparé l’expression dans les tissus articulaires de patients arthrosiques et de sujets sains.Nous montrons l’importance du TGFβI dans la régulation des processus de différenciation osseuse et chondrogénique des CSM. Nous mettons également en évidence une dérégulation au niveau transcriptionnel et protéique de ce facteur dans le cartilage, l’os sous-chondral ainsi que les CSM de patients arthrosiques. En testant son implication dans l’effet thérapeutique des CSM sur des modèles d’arthrose in vitro et in vivo, nous montrons que la diminution de son expression dans les CSM annule leur effet thérapeutique dans les modèles d’arthrose. Cet effet chondroprotecteur du TGFβI est associé à une inhibition du remodelage osseux et de la calcification des tissus mous articulaires.L’ensemble de nos résultats démontrent l’importance de la régulation de la voie TGFβ, et plus particulièrement du TGFβI, dans l’homéostasie articulaire. En parallèle, nos travaux illustrent le rôle de ce facteur dans l’effet thérapeutique des CSM, et suggèrent que l’altération de son expression dans les CSM de patients arthrosiques soit à l’origine d’une diminution de leur potentiel régénératif. / Osteoarthritis (OA) is the most common form of joint diseases without curative treatments. The disease is mainly characterized by the degradation of articular cartilage which is associated with other pathological changes in joint tissues. In this context, mesenchymal stem cells (MSC) have demonstrated a therapeutic effect. In order to identify new mediators involved in articular homeostasis, we analyzed MSC secretome, focusing on the transforming growth factor β (TGFβ) members, a central pathway dysregulated in OA.This approach allows us to identify the TGFβ induced protein (TGFβI or βIGH3). In the present study, we evaluated its role in the differentiation of MSC and compared its expression in articular tissues from OA patients and healthy donors.We highlight the importance of TGFβI in the regulation of differentiation of MSC towards bone and cartilage. We also demonstrate its dysregulation at both transcript and protein level in cartilage, bone and MSC from OA patients. We then evaluated its role in the therapeutic effect of MSC in vitro and in vivo and demonstrated that its decreased expression in MSC is associated with a loss of their therapeutic effect in OA models. The chondroprotective effect of TGFβI is associated with an inhibition of bone remodeling and calcification of soft articular tissues.Together, our results highlight the importance of the TGFβ pathway, and specially of TGFβI regulation, in joint homeostasis. Moreover, our work demonstrates its role in the therapeutic effect of MSC, suggesting that its dysregulation in OA MSC could lead to a decreased regenerative potential.

La dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) est une pathologie récessive liée au chromosome X qui résulte d’une mutation sur le gène de la dystrophine aboutissant à l’absence complète de la protéine. Elle correspond à la plus fréquente des dystrophies musculaires et reste aujourd’hui sans traitement curatif. L’UMR a fait la preuve de concept de l’administration systémique d’une population de cellules souches adultes résidentes du muscle, les cellules MuStem canines chez le chien dystrophinopathe, modèle cliniquement pertinent de la DMD. L’objectif de la thèse a consisté à caractériser la population humaine (hMuStem) en terme de phénotype, myogénicité, immunomodulation et de contexte immunologique d’administration in vivo. La population hMuStem se compose de progéniteurs myogéniques précoces d’origine mésenchymateuse-périvasculaire. Elle se définit par une forte capacité proliférative, une oligopotence et une participation à la régénération musculaire après administration dans un muscle lésé. Elles présentent des propriétés immunomodulatrices en interagissant avec l’immunité adaptative et innée par inhibition de la prolifération lymphocytaire et du complément via un ensemble de molécules de surface et/ou de facteurs sécrétés. Enfin, un traitement immunosuppressif restreint à la période d’injection in vivo de la population allogénique s’avère nécessaire mais suffisant pour éviter une réaction immune de l’hôte. L’ensemble de ces résultats aboutit à une meilleure compréhension de l’identité et des modalités d’action de la population MuStem. / Duchenne Muscular Dystrophy is a X-linked recessive disorder that results from mutation in the dystrophin gene leading to a total lack of the protein. It is the most frequent muscular dystrophy with no curative treatment. The lab made a proof of concept of the systemic delivery of a muscle-derived adult stem cell population called MuStem cells in dystrophic dog, the clinically relevant DMD model. The aim of my Ph.D. was to characterize the human population (hMuStem) in terms of phenotype, myogenicity, immunomodulation and immunological context of in vivo delivery. hMuStem cell population is composed of myogenic progenitors with mesenchymal/perivascular imprint. It exhibits a high proliferative capacity, an oligopotency and a participation to muscle regeneration after transplantation into injured muscle. It displays immunomodulatory properties by interacting with adaptive and innate immunity with inhibition of lymphocyte proliferation and complement thanks to expression of surface molecules and/or secreted factors. At last, an immunosuppressive regimen restricted to the allogeneic injection period is necessary but sufficient to avoid host immune response. Collectively, these results allow a better understanding of identity and action modalities of MuStem cell population.

L'utilisation des cellules souches est une approche prometteuse pour le traitement des maladies dégénératives neuromusculaires. De nombreuses études portent actuellement sur les cellules souches embryonnaires (ES) et les cellules pluripotentes induites par reprogrammation (IPs) dont l'utilisation en médecine régénérative reste sujette à caution à cause du potentiel de ces cellules à former des tératomes. Des lors, aussi bien les ES que les IPs nécessitent une différenciation vers un type cellulaire précis. Cette différenciation peut mener à des risques supplémentaires tels que la dérive génique ou diverses sources de contamination.Le muscle squelettique adulte, avec sa grande plasticité et capacité régénératrice, contient une population de cellules souches qui est spécifique de ce compartiment tissulaire et qui a été isolée et étudiée au laboratoire. Les cellules souches du muscle squelettique adulte: skeletal Muscle-Derived Stem Cells, MDSC, repeuplent et réparent en quelques jours le muscle squelettique lésé avec une haute efficacité, même en présence des cellules satellites endogènes. (Arsic et al Exp. Cell Res. 2008). Le laboratoire d'accueil a entrepris de caractériser cette population cellulaire, en particulier par son origine histologique, de tester le potentiel de réparation tissulaire de ces cellules transplantées dans des modèles murins, et de déterminer la bio-distribution de ces cellules en vue d'utilisation thérapeutique.Mon travail de thèse s'est intéressé à cette population de cellules souches issues du muscle qui ont une propriété commune : la faible adhérence au substrat. La faible adhérence est une propriété très intéressante car en plus de définir des cellules plus proches de l'état pluripotent, cette propriété leur confère une grande capacité de migration. Ces cellules seraient donc plus facilement utilisables en médecine régénératrice. Dans cette perspective il est intéressant de disposer de cellules souches multipotentes qui pourrait se comporter comme des cellules pluripotentes en terme de capacité régénératrice, mais sans les inconvénients de ces dernières à savoir ; risque tératogène et prolifération incontrôlée, et manipulation des cultures cellulaires longues et couteuses.Au début de ma thèse je me suis donc intéressée aux différentes populations de cellules présentes dans le muscle et je me suis concentrée sur différents marqueurs connus chez les cellules souches, dont la présence a été établie chez différentes cellules souches y compris chez les cellules souches dérivées du muscle squelettique, mais pas clairement identifiés d'un point de vue histologique. Les cellules souches du muscle expriment le facteur de pluripotence Sox2, mais aussi des marqueurs d'immaturité tels que BCRP1/ABCG2, Sca-1 et SSEA1. J'ai examiné leur potentiel de différenciation in vitro en plusieurs lineages tels que des cellules cardiaques spécifiques (dites pacemakers), des cellules productrices d'insuline et des cellules qui présentent des marqueurs neuronaux. Je me suis également concentrée sur les possibles applications thérapeutiques grâce à l'utilisation de modèles génétiques murins et notamment dans les cas de problèmes du rythme cardiaque, et du diabète insulinodépendant. Pour ces études in vivo du potentiel réparateur des MDSC on procède à une simple injection des cellules souches dérivées du muscle squelettique (MDSC). Le fait de retrouver des MDSC injectées dans les organes cibles des souris modèles pose aussi la question de la biodistribution de ces cellules dans l'organisme. J'ai donc consacré plus d'un an de mon financement doctoral pour examiner cette biodistribution et montré un recrutement ciblé dès 48h après injection, vers les organes ou tissus lésés. / The use of stem cells is a promising approach for the treatment of neuromuscular degenerative diseases. Many studies currently focus on embryonic stem cells (ES) and induced pluripotent stem cells (IPs) for use in regenerative medicine. But some problems remain for their use in cell therapy in particular the potential of these cells to form teratomas. This problem requires both ES and IPs to be differentiated towards a specific cell type. Such induction of differentiation can lead to additional risks such as genetic drift or various sources of contamination.The adult skeletal muscle, has a high plasticity and regenerative capacity, it contains a stem cell population that is specific for muscle, and has been isolated and studied in the laboratory. Adult skeletal Muscle-Derived Stem Cells, MDSC repopulate and repair damaged skeletal muscle with high efficiency in a few days, even in the presence of endogenous satellite cells. (Arsic et al Exp. Cell Res. 2008). The host laboratory is characterizing this cell population and its histological identity and testing the tissue repair potential of transplanted MDSC in mouse models, as well as their bio-distribution for therapeutic use.My thesis work addressed the study of this stem cells population isolated from skeletal muscle showing low adhesion to substrate. Poor/low adherence is an interesting property because in addition to be defined as closer to the pluripotent state, this property is associated with a higher migration capability. This population of muscle stem cells should be easier to use than pre-differentiated stem cells in regenerative medicine. In this perspective it is interesting to use multipotent stem cells that are close to pluripotent cells in terms of differentiation and regenerative capacity, but without the inconveniencies like teratogenic risk and uncontrolled proliferation, as well as expensive and time-consuming cell culture.At the beginning of my thesis I was interested by the different populations of cells present in muscle and I focused my work on known markers of stem cells, whose presence has been established in skeletal muscle, but not clearly identified histologically. Muscle stem cells expressed the pluripotency factor Sox2, but also markers, such as BCRP1/ABCG2, Sca-1 and SSEA1. I have examined the potential of MDSC to differentiate in vitro into several cell types such as cardiac pacemaker-like cells, insulin-producing cells and cells that exhibit neuronal markers. I also focused on the possible therapeutic applications of MDSC, particularly in the case of heart rhythm problems and in the case of insulin-dependent diabetes. For these in vivo studies of the repair potential of MDSC, a single systemic injection is carried out in mouse models of the diseases. The histological recovery of injected MDSC into target organs also raises the question of the biodistribution of MDSC in the body. Therefore I spent more than a year of my doctoral thesis to address this issue and showed a targeted recruitment of MDSC to injured tissue or organs within 48h of their systemic injection.

Le glaucome est une neuropathie optique associée à une augmentation de la pression intraoculaire (PIO). L’élévation de la PIO est due à la dégénérescence progressive du trabéculum. Les traitements antiglaucomateux vise à réduire la PIO, cependant il n’existe aucun traitement ciblant la dégénérescence du trabéculum. Les cellules souches mésenchymateuses (CSMs) sont utilisées comme outils thérapeutiques dans différentes pathologies dégénératives. Elles sécrètent un panel de molécules qui sont décrit comme atténuant les processus dégénératifs. L’objectif de ce travail a été d’évaluer l’intérêt des CSMs dans la prise en charge du glaucome. La caractérisation des CSMs ont été mis au point à partir de culture primaire de moelle osseuse de rat. En parallèle, un modèle expérimental de glaucome par cautérisation des veines épisclérales (EVC) a été réalisé. Nous nous sommes intéressés à l’effet de l’injection intracamérulaire des CSMs dans ce modèle. Les CSMs sont retrouvées incorporées aux tissus autour et dans le trabéculum. Les résultats obtenus in vivo montrent une diminution de la PIO par l’injection des CSMs préservant ainsi les cellules ganglionnaires périphériques de la rétine (CGRs). Par une approche in vitro, nous avons également caractérisé les effets du sécrétome des CSMs sur les cellules impliquées dans la pathologie glaucomateuse: les cellules trabéculaires et les cellules ganglionnaires de la rétine. Ces résultats ont permis de montrer que l’injection intracamérulaire de CSMs permettrait de protéger la fonction de régulation de la PIO et de protéger les CGRs dont la mort est responsable de la diminution de l’acuité visuelle chez le patient glaucomateux. / Glaucoma is a sight-threatening retinal neuropathy associated with elevated intraocular pressure (IOP) due to degeneration and fibrosis of the trabecular meshwork (TM). Glaucoma medications aim to reduce IOP without targeting the specific TM pathology, which could explain treatment failure observed in some cases. Bone-marrow mesenchymal stem cells (MSCs) are used today in various clinical studies to treat various degenerative processes. Here, we investigated the potential of MSC therapy in an ocular hypertension model. We demonstrated a rapid and long-lasting in vivo effect of MSC transplantation that significantly reduced IOP in hypertensive eyes induced by episcleral vein cauterization (EVC). MSCs were found located to the ciliary processes and the TM and are able to survive at these places. Enumeration of retinal ganglion cells (RGCs) on whole flat-mounted retina highlighted a protective effect of MSCs on RGC death. In vitro, the effect of MSC-conditioned medium (MSC-CM) on both the primary human trabecular meshwork (hTM) and RGCs showed that MSC-CM promotes: (i) hTM survival by activating the antiapoptotic pathway, Akt, (ii) hTM decontractibility as analyzed by the decrease in myosin phosphorylation and (iii) inhibition of TGF-β2-dependent profibrotic phenotype acquisition in hTM, (iiii) RGC survival and neuritic outgrowth in vitro. Finally, MSCs injection in the ocular anterior chamber in a rat model of ocular hypertension provides a neuroprotective effect in the glaucoma pathophysiology directly on RGC and indirectly via TM protection. These results originally demonstrate that MSCs represent promising tool for treating ocular hypertension and retinal cell degeneration.

Le foie a des capacités de régénérations importantes qui lui permettent de reconstituer progressivement sa masse cellulaire suite à une agression. L’induction d’une régénération hépatique est une approche qui a été utilisée dans de nombreux modèles animaux afin de favoriser la prise de greffe hépatocytaire pour le traitement des maladies métaboliques héréditaires hépatiques (MMHH). Par ailleurs, les capacités de régénération du foie sont utilisées en pratique clinique courante dans le cadre de la chirurgie hépatique afin de préparer le foie à une hépatectomie majeure. Les principaux objectifs de ce travail ont été d’étudier des moyens peu invasifs pour induire une importante régénération hépatique dans deux buts précis : i) favoriser la transplantation d’hépatocytes thérapeutiques pour le traitement des MMHH ; ii) élargir les possibilités de prise en charge des patients nécessitant une hépatectomie.Dans un premier temps, nous avons évalué l’effet d’une embolisation portale partielle (EPP) au cours de la transplantation d’hépatocytes dans un des modèles animaux de l’hypercholestérolémie familiale de type IIA, le lapin Watanabe. Dans un deuxième temps, nous avons mis au point chez le rat, une technique d’EPP résorbable répétée visant à entrainer un stimulus répété de régénération hépatocytaire afin d’envisager par la suite l’utilisation de cette technique avant transplantation d’hépatocytes. En parallèle de ces travaux fondamentaux, nous avons évalué en approche clinique l’intérêt de l’EPP résorbable avant hépatectomie majeure. Nos travaux dans le modèle du lapin Watanabe ont montré la faisabilité du protocole, une correction phénotypique in vitro, une amélioration de la prise de greffe hépatocytaire et une expression prolongée du transgène. Notre équipe a développé chez le rat un stimulus additionnel de prolifération hépatocytaire qui permet une augmentation du poids et du volume du foie non embolisé en comparaison à une seule EPP résorbable. Enfin, dans une série rétrospective préliminaire, la technique d’EPP résorbable a été utilisée avant hépatectomie majeure. L’approche a été bien tolérée chez tous les patients et a permis de systématiquement envisager la chirurgie.L’EPP résorbable est une technique peu invasive capable d’induire une régénérative hépatique efficace. Cette approche pourrait permettre notamment d’augmenter les capacités de proliférations hépatiques par la répétition du stimulus d’embolisation. A terme, l’EPP résorbable répétée pourrait permettre de modeler à la demande l’organisation du volume hépatique favorisant ainsi l’hypertrophie de tel ou tel secteur en fonction des besoins. / The liver has an important regenerative capacity allowing progressive reconstitution of the hepatic volume after an aggression. The induction of liver regeneration was used in different animal models in order to increase engraftment during hepatocyte transplantation for the treatment of inherited metabolic liver diseases (IMLD). Furthermore, liver regenerative capacities are used in routine clinical practice before liver surgery in order to prepare the liver for major hepatectomy.The main objective of this doctoral thesis was to evaluate minimally invasive approaches inducing substantial liver regeneration, focusing in two specific aims: i) increasing the engraftment of therapeutic cells for the treatment of IMLD; ii) expanding the therapeutic options for patients requiring an hepatectomy In a first study, we evaluated the impact of a partial portal vein embolization (PVE) during hepatocyte transplantation in the animal model of familial hypercholesterolemia type IIA, the Watanabe rabbit. In a second investigation, we developed an approach of repeated reversible PVE in a rat model to further boost liver hypertrophy, planning to apply this approach in hepatocyte transplantation. In parallel, we evaluated the clinical interest of reversible PVE before major hepatectomy.Our results of PVE during hepatocyte transplantation in the Watanabe rabbit model demonstrated the feasibility of the procedure, in vivo phenotypic correction, increase of liver cell engraftment and stable transgene expression. Our team developed in the rat an additional stimulus of hepatocyte proliferation allowing increase of non-embolized liver lobe weight and volume in comparison to a single reversible PVE. Finally, the reversible PVE approach was evaluated before major hepatectomy in a preliminary retrospective series of 20 patients. The procedure was well tolerated and allowed to plan surgery in all patients.Reversible PVE is a minimally invasive technique allowing to successfully induce liver regeneration. This approach could increase hepatocyte proliferation capacity by using an additional stimulus of repeated embolization. In the future, reversible PVE may allow on demand modeling of liver volumes organization by supporting the hypertrophy of a specific liver lobe when required.

Les maladies ischémiques du myocarde sont actuellement la principale cause de mortalité dans les pays développés. Malgré la diminution des délais de reperfusion et l’amélioration de la prise en charge médicale, la mortalité de l’infarctus du myocarde reste stable. Le développement de nouvelles solutions thérapeutiques reste donc nécessaire. Parmi ces nouveaux traitements, les dérivés cellulaires d'origine cardiaque (obtenues après mise en culture de fragments de biopsies) semblent prometteurs. Ces cellules sont obtenues à partir de biopsies myocardiques qui mises en culture vont spontanément s’organiser en cluster multicellulaires tridimensionnels appelés cardiosphères. La modification des conditions de culture permet ensuite d’obtenir une population de cellules uniques appelés cellules dérivés des cardiosphères (CDCs). Ces CDCs sont capables de diminuer la taille de l’infarctus dans l’infarctus constitué (études précliniques et cliniques) ainsi que dans l’infarctus aigu (ischémie reperfusion). Cependant plusieurs études réalisées chez le petit animal suggèrent que 1. Les cardiosphères pourraient avoir un potentiel thérapeutique supérieur à celui des CDCs et 2. Les exosomes sécrétés par les CDCs semblent être les médiateurs de leur effet, et l’injection des exosomes seuls pourraient permettre d’obtenir le même effet. Néanmoins, aucune étude n’a jusqu’à présent évalué les cardiosphères et les exosomes dans un modèle pre-clinique de gros animal. L’objectif de cette thèse sera donc de comparer les effets des cardiosphères, des CDCs et des exosomes sécrétés par les CDCs dans des modèles porcins d’ischémie reperfusion et d’infarctus constitué.Méthodes : Dans un premier temps, la technique de délivrance du traitement, la dose optimale et la sécurité seront évaluées ; dans un 2e temps des études randomisées contre placebo seront réalisées pour évaluer l’efficacité. Le modèle animal utilisé sera un modèle porcin d’un infarctus du myocarde reperfusé réalisé par occlusion de l’artère interventriculaire antérieure (après la première diagonale) par un ballon d’angioplastie. Pour les études d’ischémie reperfusion, les animaux seront traités 30 minutes après la reperfusion et suivi pendant 48 heures. Pour les études dans l’infarctus constitué, les animaux seront traités 4 semaines après l’infarctus puis suivi 4 semaines supplémentaires. L’efficacité sera évaluée par histologie (étendue du no-reflow et taille de l’infarctus) pour l’ischémie reperfusion, et par IRM (taille de la cicatrice et fonction ventriculaire gauche) pour l’infarctus constitué.Résultats attendus : nous espérons confirmer les résultats obtenus chez le petit animal à savoir démontrer une efficacité de cardiosphères supérieure à celle des CDCs, et une efficacité des exosomes au moins égale à celles des CDCs mais avec un profil de sécurité (notamment immunologique) supérieur. / Background: Ischemic heart disease is the first cause of death in western countries. Despite early reperfusion and improvement of medical care, myocardial infarction (MI) mortality remains constant. Therefore new treatments are desirable. Among those new treatments, heart derived cells (obtained from cardiac explants) are promising. Those cells are grown from cardiac explants which, in culture, will spontaneously self-organized in three-dimensional multicellular cluster named cardiospheres. When replated in adherent surface, those cardiospheres will yield to a population of single cells named cardiosphere-derived cells (CDCs). Allogenic CDCs have been shown to decrease infarct size both in convalescent MI (pre-clinical and clinical studies) and in ischemia-reperfusion. However several small animal studies suggest that 1. Cardiospheres may be more potent than CDCs and 2. CDC-secreted exosomes are likely to be the mediator of CDC effect and their injection may recapitulate the effect of CDCs. Nevertheless, no study has assessed the efficacy of cardiospheres and CDC-derived exosomes in a relevant pre-clinical large-animal model. We aim to compare the effect of cardiospheres, CDCs and CDC-derived exosomes in pig models of convalescent MI (adverse remodeling) and acute MI (ischemia reperfusion).Methods: First, delivery, optimal dose and safety will be optimized. Then, randomized placebo-controlled study will be performed to assess efficacy. For all studies, MI will be performed by balloon occlusion of the left anterior descending artery after the 1st diagonal. For the acute studies, pigs will be treated 30 minutes after reperfusion and followed for 48 hours. For the chronic studies, pigs will be treated 4 weeks after MI and followed for 4 additional weeks. Efficacy will be evaluated by histology (no-reflow and infarct size) for the acute studies and by MRI (scar size and left ventricular function) for the chronic studies.Expected results: we expect to confirm the results obtained in small animal models. Efficacy of cardiospheres may be better than CDCs, and exosomes should be at least as effective as CDCs but with a more favorable safety profile (especially immunological).