Les récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) sont réfractaires à l'application efficace des méthodes structurales pour étudier la structure 3D du complexe récepteur-ligands. Nous présentons une nouvelle méthode basée sur l'analyse de l'interaction ligand-RCPG à différentes températures avec le photomarquage par affinité exploitant des ligands contenant le photomarqueur pBenzoyl-L-phénylalanine (Bpa). Cette approche nous a permis de générer un modèle du complexe du récepteur d'angiotensine H de type 1 (hAT [indice inférieur 1] ) avec le [Sar [indice supérieur 1] , Bpa [indice supérieur 8] AngII à plus haute résolution et aussi d'identifier des différences conformationnelles entre la forme active et la forme inactive du récepteur. Notre laboratoire a démontré que la position 8 du [indice supérieur 125] I-[Sar [indice supérieur 1] , Bpa [indice supérieur 8] AngII formait un lien covalent avec le domaine transmembranaire 7 (DTM7) dans hAT [indice inférieur 1] . Le Bpa, qui a une sélectivité réactionnelle pour les méthionines (Met), était ambigue dans son rayon d'action variable. Néanmoins, cette sélectivité a permis d'élaborer l'essai de proximité aux Met (MPA). La température de photomarquage a été subséquemment identifiée comme un facteur important à contrôler dans les études de photomarquage. En étudiant ainsi les mutants Met positifs en MPA du récepteur hAT 1 , nous avons observé des changements importants lors de l'interaction ligand-récepteur en fonction de la température. A basse température, les fluctuations conformationnelles du complexe ligand-récepteur sont minimisées. Inversement, à 37 [degrés Celsius], le complexe démontre une flexibilité structurale très importante.Les analyses de ces résidus photomarqués suivis d'une digestion au CNBr'démontrent que l'accessibilité aux Met augmente proportionnellement avec la température. Ensuite, en photomarquant le mutant constitutivement actif, le N111G-hAT [indice inférieur 1] , nous pouvons comparer les différences entre une forme basale et une forme plus active du récepteur.Les résultats sont quantifiés en un ratio du marquage Met/DTMVII et ceci nous donne un indice d'accessibilité entre le ligand et le résidu muté dans hAT [indice inférieur 1] . Nous avons observé des différences thermodépendantes entre ces ratios d'accessibilités des mutants X[arrow right]Met et N111G/X[arrow right]Met. Ces ratios d'accessibilités ont été transformés en distance et insérés comme contraintes dans la modélisation moléculaire par refondu simulée. Nous voyons dans le récepteur un éloignement du haut du DTMVI, un rapprochement du DTMII et V et un petit déplacement du DTMIII lors de l'activation.Les différences dans les structures sont à la base des mécanismes d'activations d'hAT [indice inférieur 1] et des RCPGs en général.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usherbrooke.ca/oai:savoirs.usherbrooke.ca:11143/5813 |
| Date | January 2010 |
| Creators | Arsenault, Jason |
| Contributors | Escher, Emanuel, Lavigne, Pierre |
| Publisher | Université de Sherbrooke |
| Source Sets | Université de Sherbrooke |
| Language | French |
| Detected Language | French |
| Type | Thèse |
| Rights | © Jason Arsenault |
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