Um papel importante foi atribuído ao receptor toll-like 4 (TLR4) no desenvolvimento da placa aterosclerótica. O TLR4 foi primeiramente descrito como um receptor para bactérias gram-negativas; posteriormente foi demonstrado que sua expressão está aumentada em placas ateroscleróticas e que pacientes que possuem um polimorfismo disfuncional do TLR4 são menos suscetíveis ao desenvolvimento dessa doença. Portanto, o objetivo desse estudo foi o de investigar, em um modelo experimental de aterosclerose, a influência da deleção do TLR4 na formação e morfologia da placa aterosclerótica, no perfil lipídico e em marcadores inflamatórios. Camundongos duplo knockout (DKO), deficientes no receptor de LDL e TLR4, foram gerados cruzando-se camundongos deficientes para o receptor de LDL (LDLrKO) com camundongos deficientes para o TLR4 (TLR4KO). Todos os grupos receberam dieta rica em gordura e colesterol por 12 semanas. As concentrações plasmáticas de colesterol e triglicérides foram medidas por ensaio colorimétrico. Cortes seriados da raiz aórtica foram corados com Oil red O e as áreas de lesão quantificadas por analisador de imagens. O colágeno foi medido por coloração de picrossirius. A formação de nitrotirosina e expressão de CD40L, MMP9 e iNOS nas placas foram feitas por imunohistoquímica. As comparações foram feitas por ANOVA com pós teste de Student Newman-Keuls. Os dados foram expressos como média ± EPM. Camundongos DKO desenvolveram placas menores que camundongos LDLrKO (117.6 ±1.4 vs 198.8 ± 3.3 104m2). Camundongos TLR4KO não formaram placa. As placas dos camundongos DKO apresentaram menor núcleo lipídico que as dos LDLrKO (76.2± 13.2 vs 161.7 ± 2.9 104m2). O colágeno ao redor do núcleo lipídico é maior nos camundongos DKO do que nos LDLrKO (24.9 ± 1.8 vs 16.5 ± 2.5 % da placa). A distribuição do colágeno nos camundongos DKO ocorre principalmente ao redor da placa, de forma mais organizada, enquanto que nos LDLrKO onde sua distribuição é mais difusa. As placas dos camundongos DKO apresentaram menor expressão de CD40L e iNOS do que as dos LDLrKO (13.1 ± 0.7 vs 18.5 ± 2.5 AU e 7.7 ± 0.9 vs 10.2 ± 0.4 AU, respectivamente). A expressão de MMP9 foi menor nas placas dos camundongos DKO do que as dos LDLrKO (2.99 ± 0.3 vs 1.99 ± 0.2 AU). A marcação para nitrotirosina foi maior nos camundongos LDLrKO quando comparada com as dos grupos DKO e TLR4KO (142.89 ± 208.5, 77.16 ± 227.7 e 71.73 ± 95.9 10m2, respectivamente). Todos esses resultados sugerem que o processo inflamatório é menor na ausência do TLR4. As concentrações plasmáticas de colesterol não foram diferentes entre os grupos LDLrKO e DKO mas os camundongos LDLrKO apresentaram concentrações plasmáticas de triglicérides maiores do que os camundongos DKO após a dieta (265.2 ± 27.6 vs 150.5 ± 8.8 mg/dL). O receptor toll-like 4 influencia na estrutura e formação da placa aterosclerótica independentemente dos níveis séricos de colesterol / A crucial role has been suggested for toll-like receptor 4 (TLR4) in atherosclerotic plaque formation and development. TLR4 was described primarily, as a receptor for gram-negative bacteria lipopolisacharide; later it was showed that its expression is increased in atherosclerotic plaques and patients that carries a TLR4 dysfunctional polymorphism are less susceptible to development of this disease. Therefore, the aim of this study was to investigate, in an experimental model of atherosclerosis, the influence of TLR4 deletion in atherosclerotic plaque formation and morphology, cholesterol profile and inflammatory markers. Double knockout mice (DKO), deficient in LDL receptor and TLR4, were generated by breeding LDL receptor knockout mice (LDLrKO) with TLR4 knockout mice (TLR4KO). All three experimental groups, LDLrKO, TLR4KO and DKO were fed a high fat-cholesterol diet for 12 weeks. Plasma cholesterol and triacylglicerol concentrations were measured by colorimetric assay. Cross sections of aortic sinus were stained with Oil red O and lesion areas were quantified by an image analyzer. Collagen content was measured by picrossirius staining. We also measured nitrotyrosine formation, CD40L, MMP9 and iNOS expression by immunohistochemistry. Comparisons were made by ANOVA followed by Student-Newman-Keuls post- test. Data are mean ± SEM. DKO mice developed smaller plaques than LDLrKO mice (117.6 ±1.4 vs 198.8 ± 3.3 104m2). TLR4KO mice developed no plaque. Plaques from DKO mice have also a smaller lipid core than the ones from LDLrKO mice (76.2± 13.2 vs 161.7 ± 2.9 104m2). Collagen content around the lipid core is higher in DKO mice compared to LDLrKO mice (24.9 ± 1.8 vs 16.5 ± 2.5 % of the whole plaque). Interestingly, collagen distribution in DKO mice seems to occur mainly on the plaque periphery, in a more organized manner, while in LDLrKO mice it is fuzzier, being present also inside the plaque. Plaques from DKO present lower expression of CD40L and iNOS than LDLrKO mice (13.1 ± 0.7 vs 18.5 ± 2.5 AU and 7.7 ± 0.9 vs 10.2 ± 0.4 AU, respectively). MMP9 expression is lower in DKO mice as compared to LDLrKO mice (2.99 ± 0.3 vs 1.99 ± 0.2 AU). Nitrotyrosine staining was higher in LDLrKO mice as compared to DKO and TLR4KO groups (142. 89 ± 208.5, 77.16 ± 227.7 and 71.73 ± 95.9 10m2, respectively). All together, these findings suggest that inflammatory process is milder in the absence of TLR4. Serum cholesterol were not different between LDLrKO and DKO mice but LDLrKO presented higher triacylglicerol serum levels after 12 weeks on high fat high cholesterol diet as compared to DKO mice (265.2 ± 27.6 vs 150.5 ± 8.8). Toll like receptor 4 influences atherosclerotic plaque formation and structure independently from serum cholesterol levels
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:teses.usp.br:tde-15122008-165826 |
| Date | 22 September 2008 |
| Creators | Luiz Fonseca dos Santos Junior |
| Contributors | Heraldo Possolo de Souza, Dulcineia Saes Parra Abdalla, Sergio Paulo Bydlowski, Sergio Catanozi, Francisco Garcia Soriano |
| Publisher | Universidade de São Paulo, Ciências Médicas, USP, BR |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Source | reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP, instname:Universidade de São Paulo, instacron:USP |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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