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Previous issue date: 2015-10-29 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / A regulação gênica em tripanossomatídeos é policistrônica e ocorre de maneira pós-transcricional. Nas extremidades 5' e 3' dos RNA mensageiros existem segmentos que podem conter elementos regulatórios chamados UTR (Untranslated Regions), os quais são regiões transcritas, porém não-traduzidas. Para verificar se UTR de tamanhos diferentes possuem impacto na transcrição e, por conseguinte, na tradução de proteínas, selecionou-se genes da família de trans-sialidases, devido à importância destas no processo de invasão celular. A metodologia envolveu a extração de RNA total de T. cruzi CL-Brener, seguido da síntese de cDNA, PCR, clonagem dos produtos amplificados e seqüenciamento por Sanger e pelo uso do 454 Junior (Next Generation Sequencing \2013 NSG). Como as trans-sialidases correspondem a uma família gênica de cópias múltiplas, usou-se a estratégia de sequenciamento de alto-desempenho na tentativa de cobrir o maior número possível de genes desta família. Para isso foram obtidos cDNAs de trans-sialidases de CL-Brener nas formas epimastigota e tripomastigota com o iniciador 5\2019UTRTCNA, os quais apresentaram UTR com tamanhos variados entre 65 \2013 187 pb, além da obtenção de cDNAs para esta família de proteínas, em epimastigotas CL-Brener, com o iniciador 5\2019TcTS, apresentando UTR variando de 171 a 221 pb, com similaridade de sequências entre elas. Com o intuito de avaliar a correspondência entre a transcrição dos RNAs de trans-sialidases e a sua tradução, houve a necessidade de identificação das proteínas. Desenvolvemos uma metodologia de lise celular e produção de extrato proteico (denominado TcS12) a partir de células de T. cruzi no estágio epimastigota. As cepas selecionadas para esse estudo foram CL-Brener (TcVI), Dm28c (TcI), Y (TcII) e 4167 (TcIV)
O processo de lise celular foi otimizado para 107 parasitos/mL ressuspensos em 200 \03BCL de tampão de lise hipotônica (por 30 minutos a 40C), associado ao sonicador de banho (por 30 minutos a 40C). A eficiência da metodologia foi validada pela citometria de fluxo mostrando que aproximadamente 72% das células foram marcadas com iodeto de propídeo (PI). A qualidade dos extratos proteicos foi analisada por LCMS/MS usando-se a estratégia MSE label free para quantificação relativa de proteínas. Foram identificadas 1153 proteínas totais, cuja expressão proteica das cepas 4167, Dm28c e Y, quando comparada à CL-Brener (cepa referência), apresentou 32, 51 e 73 proteínas up-expressed, enquanto que 80, 92 e 60 proteínas mostraram-se down\2013expressed, respectivamente. Entre as trans-sialidases identificadas, a única cópia encontrada no extrato TcS12 (número de acesso no UniProt - Q4DGV8) apresentou seu RNAm correspondente no banco de dados de cDNA de CL-Brener, com UTR de 214 pb, estando, portanto, na faixa de tamanhos das outras UTR de trans-sialidases obtidas neste estudo. Esse resultado sugere que outros fatores, não necessariamente o tamanho per se das UTR, podem influenciar no fenômeno de tradução nesses tripanossomatídeos. Em relação aos extratos proteicos de epimastigotas gerados a partir das outras cepas, a quantidade de trans-sialidases identificadas foram de 1 (cepa 4167), 2 (cepa Dm28c) e 117 (cepa Y) cópias, indicando assim a tradução satisfatória de pelo menos uma das muitas cópias desta família gênica / Gene regulation in trypanosomatids is polycistronic and occurs in a post
-
transcriptional
way.
There are also regulatory elements named UTRs (Untranslated Regions) that are
transcribed regions, but not translated. To verify the impact of UTRs presenting different
sizes in the transcription machinery and protein translation, genes f
rom
trans
-
sialidas
e
family were selected due to its importance in the cell invasion process.
The
methodological strategies involved the extraction of total RNA from
T. cruzi
CL
-
Brener
strain
, followed by cDNA synthesis, PCR, cloning and sequencing of amplified products
by Sanger and by using the 454 Junior
(Next Generation Sequencing
–
N
G
S
).
Considering that trans
-
sialidase is a multi
-
copy gene family, this high
-
throughput
sequencing strategy
was employed in an attempt to cover
the
largest number of trans
-
sialidase genes. Trans
-
sialidase cDNAs from CL
-
Brener epimastigote and
tripomastigote were obtained with 5`UTRTCNA primer show
ing
UT
R sizes between 65
-
187 bp. The
cDNA
from this protein fam
ily were also obtained
with
the
5’TcTS primer
from CL
-
Brener
epimastigote
s
,
generating
UTRs with 171
-
221 bp
. Both 5’UTR
presented
sequence similarit
ies
between them. In order to evaluate the correspondence
between trans
-
sialidase gene transcription and t
ranslation, it was necessary to
accomplish the identification of proteins. Therefore, we developed a methodology for
cell
disruption, which resulted in a protein extract
(
referred
as TcS12
)
from epimastigote
T. cruzi
cells. The strains selected for this st
udy were CL
-
Brener (TcVI),
Dm28c (TcI), Y
(TcII) and 4167 (TcIV). The process for lysing the cells was optimized to 10
7
parasites/mL resuspended in 200 μL hypotonic lysis buffer (30 minutes at 4
o
C)
, followed
by
water bath sonication
(30 minut
e
s a
t
4
o
C)
. The
process
effic
acy
was confirmed by
FACS
,
showing that
near
72% of the cells were
successfully
stained with propidium
iodide solution (PI). The quality of the protein extracts was analyzed by LCMS/MS using
the strategy MS
E
label free for relative quant
ification of proteins. A totality of 1153
proteins were identified and the comparison of the expression profiles between the
strains 4167, Dm28c and Y
,
using the CL
-
Brener as reference, showed 32, 51 and 73
proteins up
-
expressed, and 80, 92 and 60 proteins
were shown to be down
-
expressed,
respectively.
We observed that 117 trans
-
sialidase
s
were identified in Y strain,
whilst
in
4167, Dm28c and CL
-
Brener were found 1, 2 and 1 trans
-
sialidases, respectively.
Moreover
only
one
copy
of trans
-
sialidase
found in
the TcS12 extract (UniProt
accession number
-
Q4DGV8), also met its corresponding mRNA in the CL
-
Brener
cDNA database, presenting an UTR of 214 bp, in the size range of the others trans
-
sialidase UTRs obtained herein. This result suggests th
at other
facto
r
s, but not
exclusively the UTR
sizes
per se
, could be related to the translation phenomenon in
these trypanosomes
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:www.arca.fiocruz.br:icict/12123 |
| Date | January 2013 |
| Creators | Paula, Tainah Silva Galdino de |
| Contributors | Vicente, Ana Carolina Paulo, Escobar, Patrícia Cuervo, Bello, Alexandre, Bourguignon, Saulo Cabral, Brandäo, Adeilton Alves, Britto, Constança Felícia De Paoli de Carvalho |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Source | reponame:Repositório Institucional da FIOCRUZ, instname:Fundação Oswaldo Cruz, instacron:FIOCRUZ |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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