A síntese de selenocisteína e sua incorporação co-traducional em selenoproteínas como resposta a um códon UGA em fase requerem uma complexa maquinaria molecular. Em eucariotos, foram identificados componentes que participam da reação de formação de selenocisteína: Seril-tRNA sintetase (SerRS), O-fosfoseril-tRNA quinase (PSTK), SECIS Binding Protein 2 SBP2, um fator de elongação específico para Sec (EFSec), selenofosfato sintetase 1 (SPS1) e selenofosfato sintetase 2 (SPS2), SEPSECS, proteína ligante de RNA SECp43, proteína ribossomal L30, um tRNA de inserção de selenocisteína (tRNASec, SELC) e uma sequência específica no RNA mensageiro (elemento SECIS). O primeiro passo da incorporação de selenocisteína em proteínas é realizado pela SerRS, que aminoacila o tRNA com serina através da ativação da serina por Mg+2 e ATP, levando a formação de um intermediário ligado a enzima (Ser-AMP). Posteriormente, ocorre a mudança do radical Ser do intermediário Ser-AMP para o tRNASec, e subsequentemente, a conversão enzimática de Ser-tRNASec para Sec-tRNASec. Através de análises in sílico nosso grupo identificou componentes da maquinaria de inserção de selenocisteína em espécies de Kinetoplastida. Foram identificados homólogos de tRNASec e as enzimas TbSerRS, TbSPS2, TbPSTK, TbSepSecS e TbEFSec. Nosso principal alvo é o estudo estrutural da SerRS de Trypanosoma brucei nativa e em complexo com o tRNASec e com as isoformas do tRNASer. Uma nova metodologia no processo de purificação desta enzima foi desenvolvida e, através das técnicas de cromatografia de exclusão molecular, espalhamento de luz dinâmico e ultracentrifugação analítica conseguimos determinar o estado oligomérico da TbSerRS. O resultado de dímeros em solução corroborou com dados reportados na literatura, além de verificarmos por meio de estudos de cinética enzimática que a enzima encontra-se ativa sob as condições utilizadas. A técnica de ultracentrifugação analítica de sedimentação em equilíbrio também nos permitiu verificar a formação do complexo SerRS-tRNA, mas não nos possibilitou definir a estequiometria deste complexo. Estudos estruturais da enzima nativa e em interação com os tRNAs SELC e com as isoformas do tRNASer, L-serina, um análogo não hidrolisável de AMP, MgCl2, e com porções menores dos tRNAs foram realizados por meio da cristalografia por difração de raios X. Através dessa técnica, dezessete conjunto de dados foram coletados, processados e estão em fase de refinamento. Algumas análises estruturais possibilitaram confirmar a presença de duas moléculas de glicerol em cada monômero na região do sítio ativo para a estrutura da TbSerRS nativa e uma molécula de dAMP para o complexo TbSerRS-dAMP. / The synthesis of selenocysteine and its co-translational incorporation in selenoproteins in response to a UGA codon in frame require complex molecular machinery. In eukaryotes, components that participate in the reaction of selenocysteine formation were identified: SeryltRNA synthetase (SerRS), O-phosphoseryl-tRNA kinase (PSTK), SECIS Binding Protein 2 - SBP2, a selenocysteine-specific elongation factor (EFSec), selenophosphate synthetase 1 (SPS1) and selenophosphate synthetase 2 (SPS2), SEPSECS, SECp43 RNA binding protein, ribosomal protein L30, selenocysteine tRNA (tRNASec, SELC), and a specific sequence in the messenger RNA (SECIS element). The first step for selenocysteine incorporating is performed by SerRS that aminoacylates the tRNA with serine through serine activation by Mg2+ and ATP leading to the formation of an intermediate linked to the enzyme (Ser-AMP). Subsequently, the change of the Ser radical to tRNASec takes place followed by the enzymatic conversion of Ser-tRNASec to Sec-tRNASec. Through in silico analysis our group has identified components of the selenocysteine insertion machinery in species of Kinetoplastida. Homologues of tRNASec and the enzymes TbSerRS, TbSPS2, TbPSTK, TbSepSecS and TbEFSec were identified. Our main target is the structural study of the native SerRS from Trypanosoma brucei and SerRS in complex with the tRNASec and the tRNASer isoforms. A new methodology in the purification process of this enzyme has been developed, and through molecular exclusion chromatography, dynamic light scattering and analytical ultracentrifugation techniques we were able to determine the oligomeric state of TbSerRS. The result of dimers in solution corroborated with the data reported in the literature. Moreover, we were able to verify through studies of enzyme kinetics that the enzyme is active. The sedimentation equilibrium analytical ultracentrifugation technique also demonstrated the formation of the SerRS-tRNA complex, however, it did not allow the definition of the complex stoichiometry. Structural studies of the native enzyme and its interaction with SELC, tRNASer isoforms, L-serine, a non-hydrolyzable AMP analog, MgCl2, and smaller portions of tRNAs were performed by X-ray diffraction crystallography. Through this technique, seventeen data sets were collected, processed, and are being submitted to refinement processes. Initial structural analysis allowed the confirmation of the presence of two glycerol molecules in each monomer in the active site region in the native structure of TbSerRS and one dAMP molecule in the TbSerRS-dAMP complex.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-31072014-161157 |
| Date | 17 April 2014 |
| Creators | Martil, Daiana Evelin |
| Contributors | Thiemann, Otavio Henrique |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | Tese de Doutorado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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