Como entre 25-50% dos isolados de Mycobacterium tuberculosis resistentes à INH não apresentam mutações nos genes katG, inhA, ahpC e kasA que possam justificar sua resistência, foi proposta a influência de mutações específicas no gene nat nos mecanismos de resistência e atividade da NAT. Todos os isolados obtidos (n=125) foram identificados e caracterizados através da amplificação pela PCR da IS6110 e por MIRU-VNTR, respectivamente. A determinação da concentração inibitória mínima (CIM) foi realizada pelo método REMA. Após triagem de mutações nos genes caracteristicamente envolvidos com resistência pela PCR-SSCP, seguida de seqüenciamento de DNA, foram selecionados 45 isolados para o estudo de mutações específicas (pela PCR e sequenciamento) e expressão gênica do mRNA do gene nat através da RT-PCR em tempo real. Confirmou-se que mutação no gene katG é a mais correlacionada com a resistência à INH, pois 68,4% das cepas resistentes apresentaram mutação neste gene. Mutações na região promotora do gene inhA, na região intergênica oxyR-ahpC e no gene kasA foram encontradas em 8,8%, 5,6% e 21,6% dos isolados, respectivamente. Mutações no gene nat, das quais 4 não haviam sido descritas previamente, foram encontradas em 40,0% dos isolados. Apesar dessas mutações causarem alterações na proteína, não foi observada uma relação direta com aumento na CIM. Também não foi observada relação entre a variação da expressão do mRNA do gene nat com os valores de CIM e com o número de mutações, tanto específicas do gene nat como em outros genes caracteristicamente relacionados com resistência à INH. / Since around 25-50% of the Mycobacterium tuberculosis strains resistant to INH do not present any mutation in katG, inhA, ahpC and kasA genes that could explain their resistance, we proposed to evaluate the influence of specific mutations in the nat gene in the mechanisms of resistance and in the activity of NAT. All strains were identified and characterized molecularly by the amplification by PCR of the IS6110 region and by MIRU-VNTR, respectively. The minimal inhibitory concentration (MIC) was performed using the REMA method. After screening of mutations in the resistant-related genes by PCR-SSCP followed by DNA sequencing, 45 strains were selected to be evaluated for specific mutations (by PCR and sequencing) and mRNA expression of nat by real time RT-PCR. It was showed that mutations in the katG gene were the most frequent and related to INH resistance since 68.4% of all resistant strains presented mutation in this gene. Mutations in the promoter region of inhA gene, oxyR-ahpC intergenic region and kasA gene were found in 8.8%, 5.6% and 21.6% of the strains, respectively. Mutations in the nat gene, four of them not previously described, were found in 40.0% of the strains. Although those mutations influence in the protein produced it was not observed a direct relation in an increase in CIM. It was also noted no relation between the expression of mRNA of nat gene neither with the MIC values nor with the number of mutations, both specific of nat gene as well in the other genes characteristically related to INH resistance.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-26052009-123442 |
| Date | 24 April 2009 |
| Creators | Cecon, Letícia |
| Contributors | Hirata, Mario Hiroyuki |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | Tese de Doutorado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
Page generated in 0.0032 seconds