A criopreservação de sêmen humano é de grande importância para a medicina
reprodutiva, porém esse processo pode causar danos ao espermatozóide devido, entre outros
aspectos, à produção de espécies reativas de oxigênio, as quais podem lesar as biomoléculas.
Tanto o resveratrol quanto o ácido ascórbico são compostos com reconhecida capacidade
antioxidante, porém ainda pouco estudados em relação à prevenção de criodanos em
espermatozóides humanos. Desta forma, o objetivo deste estudo foi analisar marcadores de
danos oxidativos e parâmetros seminais antes e após a criopreservação de sêmen humano em
presença e ausência de resveratrol e ácido ascórbico. Foram analisadas amostras de sêmen de
20 homens inférteis e 10 doadores com fertilidade comprovada. Indivíduos com
azoospermia(ausência de espermatozoides), leucocitospermia (aumento da contagem de
leucócitos seminais) ou sob uso de suplementação antioxidante foram excluídos do estudo. Os
marcadores de estresse oxidativo incluíram a avaliação dos produtos reativos ao ácido
tiobarbitúrico (TBARS) e a atividade das enzimas superóxido dismutase (Sod) e catalase
(Cat). Os danos ao DNA foram quantificados pelo ensaio Cometa. Após a análise seminal
padrão as amostras foram divididas em alíquotas, quais sejam: sem a adição de antioxidantes
(controle), com 0,1 mM, 1,0 mM, e 10,0 mM de resveratrol e 10,0 mM de ácido ascórbico.
Após uma hora de incubação as alíquotas foram criopreservadas em nitrogênio líquido a -
196°C, empregando-se o TEST-Yolk buffer como agente crioprotetor. Paralelamente, foram avaliados, ainda, os parâmetros séricos para TBARS, Sod, Cat e níveis de ácido úrico em
homens inférteis e férteis. Os resultados mostraram que o uso de ácido ascórbico e resveratrol
não causou nenhuma alteração na concentração e morfologia dos espermatozóides, porém
nenhum dos antioxidantes foi capaz de prevenir a diminuição da motilidade induzida pelo
processo de criopreservação. A criopreservação induziu uma diminuição na atividade da Sod
em indivíduos inférteis e um aumento nos níveis de TBARS nas amostras de homens férteis e
inférteis. Observou-se uma correlação negativa entre motilidade espermática e os valores de
TBARS em homens inférteis, tanto em amostras pré-congelamento (-0,868, p<0,05) quanto
em amostras pós-congelamento (-0,897, p<0,05). A adição de resveratrol às amostras,
previamente ao processo de criopreservação, preveniu a diminuição da atividade da Sod em
indivíduos inférteis e diminuiu os níveis de TBARS tanto em homens férteis como em
inférteis. O ácido ascórbico foi capaz de minimizar os danos oxidativos a lipídios causados
pela criopreservação, porém somente em sêmen de homens inférteis. Observou-se ainda que a
criopreservação induziu um significativo aumento de danos ao DNA (principalmente dos
tipos 2, 3 e 4) em homens férteis e inférteis. A adição de ácido ascórbico ao espermatozóide
reduziu os danos ao DNA em homens inférteis, mas não em homens férteis. Por outro lado, o
resveratrol foi capaz de reduzir os danos ao DNA tanto em homens férteis como em inférteis.
Salienta-se, ainda, que o uso de 10,0mM de resveratrol foi capaz de evitar todos os danos ao
DNA induzidos pela criopreservação em homens inférteis. Observou-se, também, que os
indivíduos inférteis apresentaram níveis séricos mais elevados de TBARS, ácido úrico e
atividade de Sod. Embora outros estudos sejam necessários, os dados apresentados neste
trabalho indicam a possibilidade da utilização do resveratrol e ácido ascórbico em
procedimentos de criopreservação de sêmen humano, principalmente naqueles onde a motilidade não seja essencial para ocorrer a fecundação como, por exemplo, a ICSI (injeção
intracitoplasmática de espermatozóide). / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Cryopreservation of human semen is very important in reproductive medicine, but it
may cause damages to the spermatozoa, probably due to the production of reactive oxygen
species (ROS), which may cause structural damage to the biomolecules. Resveratrol and
ascorbic acid are important antioxidants, however, until now, there are only few studies about
its use in cryopreservation process. Therefore, the aim of this study was to analyze the
oxidative stress markers and seminal standard parameters before and after the
cryopreservation of human semen with and without these antioxidants. Ejaculated semen
from 20 infertile men and 10 fertile donors, with proven fertility, were examined. Individuals
with azoospermia, leukocytospermia or under antioxidant supplementation were excluded
from the study. Oxidative stress markers including the determination of the levels of
thiobarbituric acid reactive species (TBARS) and the activity of the antioxidant enzymes
superoxide dismutase (Sod) and catalase (Cat). DNA damages were quantified by comet
assay. After the evaluation of standard seminal assays, semen samples were divided into 5
aliquots, which were treated as follows: (a) without antioxidants; (b) with 0.1 mM of
resveratrol; (c) with 1.0 mM of resveratrol; (d) with 10.0 mM of resveratrol and (e) with 10.0
mM of ascorbic acid. Samples were incubated for 1 hour and, then, they were cryopreserved
in liquid nitrogen at -196°C. The TEST-Yolk buffer was used as cryoprotector agent in all
the samples. Besides, it was evaluated, also, the seric values of TBARS, Sod, Cat and uric acid both in infertile and fertile men. The results showed that the use of ascorbic acid or
resveratrol did not change the concentration and morphology of the spermatozoids.
However, none of the antioxidants were able to prevent the decrease in the mobility induced
by the cryopreservation process. Cryopreservation causes a decrease in Sod activity in
infertile men and an increase of TBARS levels, both in infertile and fertile men. It was
observed a negative correlation between spermatozoa motility and TBARS levels in infertile
men, both before (-0, 868, p<0,05) and after (-0, 897, p<0,05) the cryopreservation process.
Resveratrol was able to avoid the decrease in Sod activity in infertile men and the increase in
TBARS levels both in infertile and fertile men samples. Ascorbic acid was able to reduce the
oxidative lipid damages induced by cryopreservation only in infertile men. It was also
observed that the cryopreservation process induced a significant increase of DNA damages
(mainly types 2, 3 and 4) in infertile and fertile men. The addition of ascorbic acid reduces
DNA damages only in infertile men. On the other hand, resveratrol was capable to reduce
DNA damages both in infertile and fertile men. In fact, the use of 10.0mM of resveratrol was
able to avoid all the DNA damages induced by the cryopreservation in infertile men.
Infertile men showed high seric levels of TBARS, uric acid and Sod activity than the fertile
men. Although other studies are necessary, the data presented in this work suggests the
possibility to use resveratrol and ascorbic acid in human cryopreservation procedures, both for
fertile and infertile men, at least, for ICSI (Intracytoplasmic Sperm Injection), as it does not
need motile sperm for achieving pregnancy.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:repositorio.ucs.br:11338/692 |
| Date | 16 December 2011 |
| Creators | Garcez, Márcia Esteves Silva |
| Contributors | Guecheva, Temenouga Nikolova, Madi, José Mauro, Paesi, Suelen Osmarina, Salvador, Mirian, Erdtmann, Bernardo, Pasqualotto, Fábio Firmbach |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UCS, instname:Universidade de Caxias do Sul, instacron:UCS |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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