Influenza A besitzt ein segmentiertes, achtsträngiges Genom in negativer Orientierung. Die einzelnen Segmente sind in virale Ribonukleoproteinkomplexe (vRNPs) verpackt. Genomische Segmentierung erlaubt es Influenza, zwischen verschiedenen Stämmen Reassortierung zu betreiben, was zur Entstehung von hochgradig virulenten und potentiell pandemischen neuen Stämmen führen kann.
Die Existenz eines Packungsmechanismus wird vermutet, der sicherstellt dass exakt ein Segment jeden Typs in neu knospende Viren verpackt wird. Es gibt Indizien dafür, dass die vRNPs während ihres Wegs vom Nukleus zur Plasmamembran, wo die Knospung stattfindet, Multi-Segment-Komplexe ausbilden, die durch RNA-RNA-Interaktionen, sog. Packungssignale vermittelt werden. Dieser Prozess ist allerdings noch nicht hinreichend verstanden.
In dieser Arbeit wurde eine neue RNA-FISH-Methode namens MuSeq-FISH entwickelt und angewendet, um die spektralen Limitierungen bisheriger Multiplexing-Ansätze zu überwinden und alle vRNA- und mRNA-Spezies vom humanen Stamm A/Panama des Influenza A Virus zu visualisieren. Außerdem wurde ein automatisierter Arbeitsablauf zur Registrierung/Ausrichtung, Punktdetektion, computergestützter Kolokalisationsanalyse und kombinatorischer Analyse der Mikroskopiebilder entwickelt, der auch große Datenmengen verarbeiten kann. Erstmalig wurde damit eine vollständige Kartographierung der Lokalisation und Häufigkeiten alle viralen RNAs in einzelnen Zellen vorgenommen. Aus diesen Daten konnten wir Erkenntnisse zu den Mechanismen und möglichen Hierarchien innerhalb des Packungsprozesses gewinnen. Dazu wurden Reaktionspfade und statistische Analysen von über 60 einzelnen Zellen und mehr als 105 einzelner vRNPs herangezogen. Es wurden auch Informationen über die vRNP-Häufigkeiten und deren Unterschiede zwischen Einzelzellen gewonnen, die zeigen dass sich Infektionsumgebungen auch in großer räumlicher Nähe stark unterscheiden und dadurch den Verpackungsmechanismus beeinflussen können. Weiterhin wurde eine Modellierung basierend auf bedingten Wahrscheinlichkeiten genutzt, um Reaktionskonstanten aus statischen FISH-Daten zu erhalten.
Wir haben unsere Analysen zusätzlich auf den aviären Stamm A/Mallard und die reassortanten Stämme A/Pan-M, A/Pan-NS und A/Pan-NSM erweitert, die ein gemischtes Genom aus A/Panama und A/Mallard enthalten. Dabei konnte gezeigt werden, dass sich die Packungsdynamiken und -netzwerke auch zwischen nah verwandten Stämmen erheblich unterscheiden. Heterogene Verpackungsprozesse wurden für diese Stämme observiert, anhand welcher A/Pan-M und A/Pan-NS eher A/Mallard zugeordnet werden konnten.
Ebenfalls wurden erste Schritte unternommen, um die Methode in verschiedener Hinsicht zu erweitern: es zeigte sich, dass MuSeq-FISH und STED-Mikroskopie im Prinzip kombinierbar sind, was auch durch gleichzeitige Detektion von drei vRNA-Segmenten gezeigt werden konnte. MuSeq-FISH wurde auch genutzt, um einzelne Virionen direkt nach deren Eintritt in die Zelle zu färben und auf deren genomischen Inhalt hin zu untersuchen. Dabei fiel auf, dass die Segmente 7 und 8 besonders häufig fehlten, wenn unvollständige Genome detektiert wurden. Außerdem wurde ein Plasmidsystem auf Basis des pHW2000-Vektors für fast alle Segmente von A/Panama umkloniert, welches nun die Expression von mRNA ohne die gleichzeitige Expression von vRNA ermöglicht. In einem ersten Experiment konnte die Funktionalität des Systems gezeigt werden, so dass es potentiell in Transfektionsexperimenten die Untersuchung vom Packungsmechanismus ermöglichen kann, und zwar unter infektionsähnlichen Bedingungen mit beliebig kombinierbaren vRNA-Sets.
Wir erwarten, dass MuSeq-FISH zusammen mit dem automatisierten Arbeitsablauf auch eine nützliche Methode für andere biologische Fragestellungen darstellen wird, besonders wenn es um hochgradig kolokalisierte Untersuchungsobjekte geht. Fundiertes Wissen über den Packungsmechanismus von Influenzaviren kann helfen, die Entstehung von pandemischen Stämmen besser zu verstehen und kann Möglichkeiten aufzeigen, neue antivirale Medikamente zu entwickeln. / Influenza A has a segmented genome of eight single-stranded, negative-sense RNAs packed into ribonucleoproteins (vRNPs). This segmentation allows reassortment between different strains with the potential to create highly virulent, pandemic new strains. A packaging mechanism is supposed, ensuring the incorporation of one copy of each segment species into budding virions. En route from the nucleus to budding at the plasma membrane, the vRNPs are thought to form multisegment complexes via RNA-RNA and RNP-RNP interactions called packaging signals. This process is not yet completely understood.
Here, a new RNA-FISH method (MuSeq-FISH) was introduced to overcome the spectral limits of multiplexing in order to visualize all IAV vRNA and mRNA targets of the human strain A/Panama. An image processing pipeline including image registration, spot detection, automated colocalization analysis and combinatorial analysis was developed, capable of high data throughput. For the first time, a complete map of the localization and abundance of all viral RNAs in individual cells has been generated. This data enabled detailed investigations about the mechanisms and potential hierarchies within the packaging process, which were inferred from pathways and statistical analysis of over 60 individual cells with more than 105 vRNP occurrences. We also gained information about the abundance and cell-to-cell heterogeneity of vRNPs among large sets of infected cells, unravelling that infection environments even in neighboring cells differ strongly in segment composition with an impact on packaging. In addition, conditional probability modelling was conducted to infer reaction constants from inherently static FISH data.
We have extended this analysis to the avian strain A/Mallard and the reassortant strains A/Pan-M, A/Pan-NS and A/Pan-NSM, which contain reassorted genomes of A/Panama and A/Mallard. Here we have shown that packaging dynamics and networks differ widely, even among closely related strains. Packaging processes in these strains seemed to be very diverse, however we found A/Pan-M and A/Pan-NS to more closely resemble A/Mallard in terms of packaging.
First steps have been taken to extend the method into different directions: combi- nation of MuSeq-FISH with STED imaging is in principle possible and has been applied for simultaneous detection of three vRNA species. MuSeq-FISH was also applied to single IAV virions directly after cell entry in order to study their genome content, where we found segments 7 and 8 to be lacking most frequently. In addition, a system of pHW2000-based plasmids expressing only mRNA has been created for almost all A/Panama segments. The functionality of this system was shown in a proof of concept, so that its use in transfection experiments can serve as a potential instrument to investigate vRNP packaging in artificial infection-like conditions with reduced vRNAs sets of choice.
MuSeq-FISH together with its image analysis pipeline will be a useful tool also for other biological questions, especially concerning high-grade colocalization. Further understanding of the vRNP packaging in influenza can help us to understand the emergence of pandemic strains and open up paths to new antiviral medication.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:HUMBOLT/oai:edoc.hu-berlin.de:18452/19040 |
| Date | 14 September 2017 |
| Creators | Prisner, Simon |
| Contributors | Herrmann, Andreas, Selbach, Matthias, Löwer, Alexander |
| Publisher | Humboldt-Universität zu Berlin |
| Source Sets | Humboldt University of Berlin |
| Language | English |
| Detected Language | German |
| Type | doctoralThesis, doc-type:doctoralThesis |
| Format | application/pdf |
| Rights | Namensnennung-NichtKommerziell-KeineBearbeitung 3.0 Deutschland, http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/de/ |
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