Diabetes ist ein weltweites Problem, das durch den Verlust oder die Dysfunktion der Insulin-produzierenden β-Zellen des Pankreas verursacht wird. In seltenen Fällen entsteht Diabetes durch eine Mutation in einem einzigen Gen. Diese monogenetischen Formen des Diabetes können zur Identifizierung neuer Regulatoren der β-Zellen-Entwicklung und -Funktion beitragen.
In der vorliegenden Arbeit habe ich neue putative Diabetes-assoziierte Gene untersucht, die zuvor durch „Next-Generation“ Sequenzierung in einer Gruppe von Kindern und Jugendlichen mit idiopathischem Diabetes festgestellt wurden. Insbesondere analysierte ich neuartige Mutationsvarianten in Genen kodierend für Histone deacetylase 4 (HDAC4), Glioma-associated oncogene homolog 1 (GLI1) und Glioma-associated oncogene homolog 2 (GLI2). Basierend auf den folgenden Kriterien wurden diese Transkriptionsregulatoren zur weiteren funktionellen Analyse priorisiert: Genetische Information, Patientenphänotyp und Expressionsprofil der Kandidaten Gene in Mauspankreas-Vorläuferzellen. Um die Rolle der Varianten während der pankreatischen Zelltypspezifizierung zu untersuchen, nutzte ich die CRISPR-Cas9 Methode in Kombination mit Stammzellendifferenzierung. Im Detail generierte ich diverse Stammzellen mittels CRISPR-Cas9, die die Mutationsvarianten der Patienten trugen und differenzierte diese zu β-ähnlichen Zellen. Weitere in vitro und Transkriptionsanalysen zeigten, dass die Variante c.C4661T in GLI2 die Entwicklung der β-ähnlichen Zellen beeinträchtigte, was für eine genetische Prädisposition zur Entwicklung von Diabetes verantwortlich sein kann. Zusätzlich nutzte ich diese Plattform, um neue extrinsische Faktoren zu untersuchen und zeigte, dass die fördernde Rolle von HC toxin (HDAC Inhibitor) und SLIT3 (ROBO Ligand) konserviert ist.
Zusammenfassend habe ich eine Differenzierungsplattform etabliert, um die Rolle von genetischen und extrinsischen Faktoren für die Entwicklung des Pankreas und/oder β-Zellen zu untersuchen. / Diabetes is a worldwide health problem caused by the loss or dysfunction of the insulin-secreting β-cells in the pancreas. Unelucidated forms of monogenic diabetes, arising from rare mutations in one single gene, represent invaluable models for identifying new targets of β-cell development and function. In this study, I focused on putative disease-associated genes for diabetes that have been previously identified by next-generation sequencing of a cohort of patients with puberty-onset diabetes. In particular, I investigated unique mutant variants in genes coding for Histone deacetylase 4 (HDAC4), Glioma-associated oncogene homolog 1 (GLI1) and Glioma-associated oncogene homolog 2 (GLI2). These transcriptional regulators were prioritized for functional analysis based on patient phenotype, expression level in pancreas progenitor cells and available genetic information. To investigate the role of the genetic mutant variants in pancreatic cell fate decisions and cell function, I used the CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeat)-Cas9 genome editing technology in combination with human induced pluripotent stem cell (iPSC)-directed β-cell differentiation. Employing these approaches, I established several patient-like iPSC lines carrying the identified heterozygous missense variants. Specifically, functional experiments and whole transcriptome analysis showed that the variant c.C4661T in GLI2 impairs human β-cell differentiation and β-cell function, which might be responsible for a genetic predisposition to develop diabetes. In addition, I used the same iPSC-based differentiation model system to study novel extrinsic factors, namely the HDAC inhibitor HC toxin and the ROBO ligand SLIT3 and uncovered their conserved role in enhancing human β-cell development. Taking together, I established a human iPSC differentiation platform to study critical genes and extrinsic factors that are necessary for human pancreas development and/or β-cells.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:HUMBOLT/oai:edoc.hu-berlin.de:18452/23268 |
| Date | 31 March 2021 |
| Creators | Müller, Laura Mara |
| Contributors | Landthaler, Markus, Spagnoli, Francesca, Spuler, Simone |
| Publisher | Humboldt-Universität zu Berlin |
| Source Sets | Humboldt University of Berlin |
| Language | English |
| Detected Language | English |
| Type | doctoralThesis, doc-type:doctoralThesis |
| Format | application/pdf |
| Rights | (CC BY-NC-ND 4.0) Attribution-NonCommercial-NoDerivatives 4.0 International, https://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/ |
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